【摘要】：當(dāng)前,心腦血管疾病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)致死率極高的一類疾病。其中,動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ),發(fā)病原因復(fù)雜,目前缺乏針對(duì)性治療方法�，F(xiàn)代研究表明,炎癥抑制是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)治療的新道路。在免疫系統(tǒng)中,巨噬細(xì)胞是參與AS的首要細(xì)胞,并在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,若可以抑制巨噬細(xì)胞向AS發(fā)病部位的遷移,就可以在對(duì)免疫系統(tǒng)影響較小的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)AS的早期防治,延緩AS的病情發(fā)展。水蛭是傳統(tǒng)中藥,具有逐惡血、淤血,破血消積聚的作用,臨床上主要用于心腦血管疾病的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)水蛭酶解物能減少載脂蛋白E(ApolipoproteinE,ApoE)基因敲除小鼠體內(nèi)AS斑塊處巨噬細(xì)胞數(shù)量,對(duì)AS的形成和發(fā)展具有顯著的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,由于巨噬細(xì)胞向內(nèi)皮下層的遷移活動(dòng)在AS病情發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用,本課題擬從水蛭中提取、分離純化得到一個(gè)具有抑制巨噬細(xì)胞遷移活性的水蛭肽,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探究。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.活性追蹤下通過(guò)離子交換柱層析和凝膠柱層析分離純化得到水蛭肽HP以LPS誘導(dǎo)小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生遷移,借助transwell小室共同構(gòu)建細(xì)胞遷移模型。水蛭經(jīng)過(guò)初步酶解等處理后得到水蛭酶解物HE,在使用tranwell小室法進(jìn)行活性追蹤的基礎(chǔ)上,經(jīng)過(guò)Q Sepharose強(qiáng)堿性陰離子交換柱層析得到5個(gè)峰組分,檢測(cè)選取其中具有抑制遷移活性的HE3進(jìn)行Superdex 30凝膠柱層析得到HE31,接下來(lái)使用Superdex Peptide凝膠柱層析初步得到水蛭肽HP0,經(jīng)過(guò)Sephadex G10凝膠柱層析脫鹽后得到水蛭肽HP,經(jīng)過(guò)transwell小室檢測(cè)和劃痕實(shí)驗(yàn),均表明其具有抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞遷移的活性。2.HP通過(guò)影響MEKK4和ASK2的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞遷移的活性將HP分別與p38 MAPK、JNK、ERK、NF-κB和Src的抑制劑合用,通過(guò)transwell小室法檢測(cè)巨噬細(xì)胞遷移活性以確定HP的活性機(jī)制。結(jié)果顯示,與單獨(dú)使用抑制劑相比,當(dāng)HP分別與p38MAPK、JNK半數(shù)抑制劑合用時(shí),并未出現(xiàn)抑制遷移效果的疊加,而HP與Src、NF-κB和ERK抑制劑合用時(shí),抑制效應(yīng)有所加強(qiáng),這說(shuō)明HP抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移的作用可能與p38 MAPK、JNK有關(guān),而與ERK、NF-κB和Src無(wú)關(guān)。由于p38 MAPK和JNK同屬于MAPK通路中的激酶,使用PCR對(duì)p38和JNK上游激酶MKK4、MLK3、MEKK3/4、ASK1/2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè),結(jié)果顯示,HP影響MEKK4和ASK2的轉(zhuǎn)錄,可能通過(guò)此方式調(diào)節(jié)各激酶水平來(lái)抑制巨噬細(xì)胞遷移活性,從而解釋了宏觀實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出的抑制遷移活性。綜上所述,本課題首次從寬體金線蛭中分離純化得到一個(gè)水蛭肽HP,證實(shí)它通過(guò)影響MAPK通路中MEKK4和ASK2的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響下游p38 MAPK和JNK的作用,從而一定程度上抑制巨噬細(xì)胞遷移。在對(duì)免疫細(xì)胞影響盡量小的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)AS的早期預(yù)防,延緩AS病情發(fā)展,這對(duì)AS的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,為AS早期防治提供治療新思路和新策略,同時(shí)對(duì)水蛭的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R945;R96

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本文編號(hào)：2545210