【摘要】：為從Myxococcus macrosporus STXZ54發(fā)酵液中高效地分離純化出抗腫瘤活性蛋白WGF5,收集STXZ54發(fā)酵上清液,先后利用優(yōu)化后的硫酸銨沉淀方法沉淀蛋白,強(qiáng)陽(yáng)離子交換、分子篩色譜分離等方法對(duì)蛋白粗提物進(jìn)行精細(xì)分離.利用CCK-8試劑盒,倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡等觀察WGF5對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響,臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)一步檢測(cè)WGF5對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到WGF5能夠顯著改變腫瘤細(xì)胞形態(tài),與原分離體系相比較,優(yōu)化后的抗腫瘤活性蛋白分離方法更為高效,簡(jiǎn)便易行.
【圖文】：

7721的毒力將在六孔板接種的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，實(shí)驗(yàn)組加入10mg/LWGF5，而對(duì)照組加入相同體積的PBS，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都做相同時(shí)間梯度:0，24，36，48，60h．收集細(xì)胞PBS洗滌2次后，80μL無(wú)菌去離子水重懸細(xì)胞，然后加入80μL臺(tái)盼藍(lán)染色液常溫染色5min，細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的死亡率．2結(jié)果與分析2．1硫酸銨分級(jí)沉淀抗腫瘤活性蛋白利用硫酸銨分級(jí)沉淀梯度分別為0%～35%，35%～70%，70%～100%，40%～75%分級(jí)沉淀出的4組蛋白，作用B16腫瘤細(xì)胞24h，CCK-8試劑盒測(cè)定各組樣品的腫瘤細(xì)胞抑制率．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-a所示，各飽和度下沉淀的蛋白均對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，且35%～70%飽和度區(qū)沉淀出蛋白的細(xì)胞毒性為83%，顯著高于其他三組蛋白的抗腫瘤活性．硫酸銨分級(jí)沉淀濃度為40%～75%時(shí)(原方法所使用的硫酸銨分級(jí)沉淀濃度梯度)，其沉淀出的蛋白細(xì)胞毒性在73%左右．SDS-PAGE檢測(cè)硫酸銨分級(jí)沉淀梯度分別為35%～70%(圖1-b，泳道1)、40%～75%(圖1-b，泳道2)沉淀出的兩組樣品的蛋白條帶發(fā)現(xiàn)，二者蛋白成分相近，且35%～70%硫酸銨分級(jí)沉淀出的蛋白中WGF5含量較高．因此，考慮選用35%～70%硫酸銨梯度沉淀法沉淀抗腫瘤活性蛋白．2．2強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離抗腫瘤活性蛋白將提取的抗腫瘤活性粗提蛋白用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行分離，分離結(jié)果如圖2-a所示，圖中出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰，穿透峰(峰A)在色譜程序開(kāi)始后不久就被洗脫下來(lái)，峰面積較大，最高點(diǎn)接近3500mAU．緊隨峰A被洗脫下來(lái)的色譜峰(峰B)，保留時(shí)間為6．5min．收集各峰進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，并對(duì)A和B兩活性峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明WGF5在峰B中．大量收集活性峰B，進(jìn)行下一步分離純化．圖1硫酸銨沉淀分離抗腫瘤活性蛋白Fig．1Separationofantitumoractiveproteinsbyammoniumsulfateprec

魏慧等:大孢粘球菌抗腫瘤活性蛋白WGF5分離方法的優(yōu)化與活性分析圖3分子篩色譜分離抗腫瘤活性蛋白Fig．3Separationofantitumoractiveproteinsbymolecularsievechromatography圖4SDS-PAGE檢測(cè)活性蛋白純度Fig．4DetactionofproteinsbySDS-PAGE2．5臺(tái)盼藍(lán)染色觀察WGF5對(duì)B16細(xì)胞的毒性作用用4%臺(tái)盼藍(lán)染色液對(duì)WGF5作用不同時(shí)間的B16細(xì)胞進(jìn)行染色．早期凋亡的細(xì)胞及未死亡的細(xì)胞中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較完整，不易被臺(tái)盼藍(lán)染液染成藍(lán)色，從而可以通過(guò)這種染色手段將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)．從圖5可以看出，隨作用細(xì)胞的時(shí)間增大，被染色的死細(xì)胞數(shù)目比例逐漸增加．在WGF5作用48h后，細(xì)胞死亡比例達(dá)到了67%，而之前CCK-8試劑盒測(cè)得細(xì)胞死亡率在67%之上，，可以分析得出在CS3作用細(xì)胞期間，細(xì)胞可能發(fā)生了早期凋亡．2．6掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化掃描電子顯微鏡觀察WGF5對(duì)B16細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖6所示，在對(duì)照組中，B16細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞形態(tài)正常．實(shí)驗(yàn)組中B16細(xì)胞的細(xì)胞偽足消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)坍塌瓦解，細(xì)胞變圓死亡，足見(jiàn)WGF5對(duì)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒力．圖5WGF5對(duì)腫瘤細(xì)胞存活率的統(tǒng)計(jì)分析Fig．5StatisticalanalysisoftheB16cellssurvivalratewhentreatedwithWGF5圖6掃描電鏡觀察B16細(xì)胞的形態(tài)變化(8000×)Fig．6B16cellswereanalyzedwithscanningelectronmicroscopy(8000×)3討論粘細(xì)菌是最高級(jí)的微生物類(lèi)群，科研工作者從中挖掘抗腫瘤新藥物的研究體系也日趨完善［14］．就目前研究現(xiàn)狀來(lái)看，粘細(xì)菌抗腫瘤新藥物的開(kāi)發(fā)潛力遠(yuǎn)大于放線(xiàn)菌［15］．2014年Jansen等從粘細(xì)菌Nannocystispu-sillaNaa174菌株中分離得到的pyrronazolsC1和C2兩種活性物質(zhì)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系均有抑制作用，其中對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的活性?
【作者單位】： 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室淡水魚(yú)類(lèi)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家“973”基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012CB722301) 湖南省“生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心”資助項(xiàng)目(20134486)
【分類(lèi)號(hào)】：R915

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉元江;;組蛋白去乙�；敢种苿┑目鼓[瘤活性[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊(cè));2007年01期

2 周雙生;程俊;賈勇;謝復(fù)新;;新型鉑(Ⅱ)配合物的合成及其抗腫瘤活性[J];化學(xué)試劑;2007年06期

3 王海英;張麗萍;葛文中;;甾體肟的合成及抗腫瘤活性的研究[J];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

4 馮娟;李建其;;N-(氨基吡啶)苯甲酰胺類(lèi)衍生物的合成與抗腫瘤活性[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2009年12期

5 吳春華;陳藝勤;邱恬;姚閩娜;龐杰;;多糖微觀構(gòu)象與抗腫瘤活性關(guān)系研究進(jìn)展[J];中國(guó)糧油學(xué)報(bào);2011年04期

6 陳衛(wèi)民,曾隴梅,徐繼紅,吳曙光;3,3’-(二硒雙甲叉)雙(5-羥基-6-甲基4-吡啶甲醇)的合成及抗腫瘤活性[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);1999年03期

7 陳琪,朱海亮,戚穗堅(jiān),彭文烈,徐安龍;六氮雜大環(huán)希夫堿與銀(Ⅰ)系列配合物的抗腫瘤活性研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年02期

8 王新楊;徐浩;吳曉明;黃文龍;周金培;;異穿心蓮內(nèi)酯衍生物的合成及其抗腫瘤活性[J];中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年06期

9 周燕;趙硯瑾;李庶心;鄧曉東;;苯丙烯酰胺類(lèi)化合物的合成及抗腫瘤活性研究[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);2012年02期

10 胡揚(yáng)根;高海濤;王剛;王燕;屈永年;徐靖;;新型2-氨基-呋喃并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮衍生物的合成及抗腫瘤活性[J];有機(jī)化學(xué);2012年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊會(huì)成;曾名勇;董士遠(yuǎn);劉尊英;李瑞雪;郭玉華;;海帶多酚的分離、純化及抗腫瘤活性[A];2007年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)暨水產(chǎn)微生態(tài)調(diào)控技術(shù)論壇論文摘要匯編[C];2007年

2 胡人杰;;我國(guó)天然抗腫瘤活性成分的研究進(jìn)展[A];2007醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

3 張巖;高世勇;季宇彬;;多糖結(jié)構(gòu)修飾對(duì)抗腫瘤活性影響的研究進(jìn)展[A];第六屆肉蓯蓉暨沙生藥用植物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

4 尚海;陳虹;郝飛躍;劉永峰;潘莉;程卯生;;新型吲哚衍生物的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究[A];2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集[C];2010年

5 黃燕敏;崔建國(guó);甘春芳;宋化燦;;6-取代-4-氮雜-A-homo-3-氧代膽甾化合物的合成及抗腫瘤活性研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第27屆學(xué)術(shù)年會(huì)第06分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2010年

6 王朋;畢秀麗;郭玉梅;樸虎日;趙余慶;;25-OH-PPD脂肪酸酯類(lèi)衍生物的合成和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)[A];2011年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第11屆中國(guó)藥師周論文集[C];2011年

7 馮貝貝;周廣強(qiáng);于康;王惠;張秋榮;劉宏民;;2-吲哚酮衍生物的合成及抗腫瘤活性評(píng)價(jià)[A];2011年全國(guó)藥物化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

8 劉丹;李曉靜;鄭小洲;盛志成;霍春芳;趙臨襄;;2-(E)-取代-苯基亞甲基-6-(N-取代-胺甲基)環(huán)己酮/環(huán)己醇類(lèi)化合物的合成及抗腫瘤活性研究(英文)[A];第十一屆全國(guó)青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集[C];2012年

9 侯寶龍;王翠玲;張寧;劉建利;;喹喔啉類(lèi)衍生物的合成和抗腫瘤活性研究[A];第十一屆全國(guó)博士生學(xué)術(shù)年會(huì)（生物醫(yī)藥專(zhuān)題）論文集（中冊(cè)，墻報(bào)P1-P24）[C];2013年

10 宣偉;丁雯;李義平;惠宏襄;張三奇;;4-甲基哌嗪甲酰基二芳基脲的合成和抗腫瘤活性[A];2011年全國(guó)藥物化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳靜;咔啉及其類(lèi)似物的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究[D];浙江大學(xué);2009年

2 李德海;深海微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性成分研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2007年

3 畢重文;新型N-取代槐定酸類(lèi)似物的設(shè)計(jì)、合成及其抗腫瘤活性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 張穎杰;新型組蛋白去乙�；敢种苿┑脑O(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究[D];山東大學(xué);2012年

5 李靜;（R）-四氫噻唑-2-硫酮-4-羧酸的應(yīng)用研究兼論羧酸金剛烷胺鹽的合成及抗腫瘤活性[D];吉林大學(xué);2008年

6 田智勇;酰亞胺衍生物合成與抗腫瘤活性評(píng)價(jià)[D];天津大學(xué);2009年

7 劉紅椿;桔霉素三聚體Tricitrinol B的抗腫瘤活性及機(jī)制研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2009年

8 郭淑春;3-芳基-8H-噻吩并［2，3-b］吡咯里嗪類(lèi)化合物的設(shè)計(jì)、合成與抗腫瘤活性研究[D];沈陽(yáng)藥科大學(xué);2007年

9 袁健;手性釕配合物Λ-WH0402的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

10 黃偉;新型類(lèi)黃酮衍生物的設(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究[D];華中師范大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王紅葉;葉酸介導(dǎo)白蛋白包載長(zhǎng)春堿納米粒體內(nèi)外抗腫瘤活性評(píng)估[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

2 吳永成;基于環(huán)高價(jià)碘摀鹽的菲和咔唑類(lèi)化合物的構(gòu)建、表征分析及其抗腫瘤活性研究[D];廣東藥學(xué)院;2015年

3 李祥華;新型吉西他濱衍生物的設(shè)計(jì)、合成及其抗腫瘤活性研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 頓艷艷;嘧啶芐基異羥肟酸類(lèi)靶向抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與抗腫瘤活性研究[D];山東大學(xué);2015年

5 劉豐喜;多取代靛紅衍生物的合成與抗腫瘤活性研究[D];天津科技大學(xué);2014年

6 楊康利;南極海洋芽孢桿菌多肽PBN11-8的分離純化及抗腫瘤活性研究[D];青島科技大學(xué);2015年

7 侯金寧;APN抑制劑LJNK與基于APN的協(xié)同前藥BC-A1的抗腫瘤活性研究[D];山東大學(xué);2016年

8 李敏;含噻唑并[3,2-b][1,2,4]三唑-6(5H)-酮等結(jié)構(gòu)的考布他汀A4衍生物的合成及抗腫瘤活性研究[D];延邊大學(xué);2016年

9 王春蘭;ATB-429和IMB-1506衍生物的設(shè)計(jì)、合成與抗腫瘤活性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

10 張卉;新型喜樹(shù)堿類(lèi)化合物ZH-001的抗腫瘤活性及其分子機(jī)制研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2538874