【摘要】：研究目的骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜,現(xiàn)在的研究表明補(bǔ)體系統(tǒng)在OA的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,而補(bǔ)體系統(tǒng)的替代途徑在OA中又占據(jù)主要位置。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)是由D-葡糖醛酸殘基和N-乙酰-D-半乳糖胺殘基組成的雙糖單位線性連接組成的一類糖胺聚糖,大量的研究表明其具有緩解、治療OA的生物學(xué)功能。其中低分子量硫酸軟骨素(1owmolecular weight chondroitin sulfate,LMWCS)在緩解、治療OA方面效果更加明顯。但是1MWCSs通過(guò)與補(bǔ)體系統(tǒng)相互作用起到防治OA的作用目前尚未有研究。同時(shí)LMWCSs由于來(lái)源不同、制備工藝不同等導(dǎo)致其具有不同的生物活性,探討LMWCS s與抗補(bǔ)體活性的構(gòu)效關(guān)系,闡明LMWCSs的結(jié)構(gòu)對(duì)補(bǔ)體活性的影響,將對(duì)LMWCSs防治OA奠定一定的理論基礎(chǔ),同時(shí)對(duì)LMWCSs的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。為了探討CS抗補(bǔ)體作用與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系及抗補(bǔ)體作用在其防治OA中發(fā)揮的作用,本研究采用4種不同的降解方法對(duì)3種不同來(lái)源的CS進(jìn)行降解得到一系歹LMWCSs,然后對(duì)這些LMWCSs的抗補(bǔ)體活性進(jìn)行評(píng)價(jià),研究LMWCSs結(jié)構(gòu)與抑制補(bǔ)體替代途徑活性之間的構(gòu)效關(guān)系,并選出一種抗補(bǔ)體活性較高的LMWCS。通過(guò)對(duì)活性較高的LMWCS的體內(nèi)、體外的活性評(píng)價(jià),證明其抗補(bǔ)體活性與其防治OA的關(guān)系。最后,針對(duì)于目前篩選CS的抗補(bǔ)體活性的方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問(wèn)題,通過(guò)利用近紅外光譜分析技術(shù)建立一種快速無(wú)損的高通量篩選CS抗補(bǔ)體活性的方法。研究方法1 LMWCSs的制備及表征本研究擬采用氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波輔助堿降解法對(duì)鯊魚來(lái)源、豬來(lái)源和牛來(lái)源的CS進(jìn)行降解得到不同的LMWCSs。采用傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography,HPLC)、紫外可見光譜法、分子排阻色譜-多角度激光散射法(size exclusion chromatography-multi angle light scattering, SEC-MALLS)、核磁(ruclear magnetic resonance,NMR)等方法對(duì)LMWCSs的性質(zhì)進(jìn)行表征和研究。2不同LMWCSs的抗補(bǔ)體活性研究與構(gòu)效關(guān)系分析采用溶血法測(cè)定LMWCSs抑制替代途徑活性的IC50值,通過(guò)利用性質(zhì)的表征結(jié)果對(duì)LMWCSs的結(jié)構(gòu)和LMWCSs的抗補(bǔ)體活性之間的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究,分析其構(gòu)效關(guān)系,進(jìn)而選擇出一種具有較好的抗補(bǔ)體活性的LMWCS用于進(jìn)一步的體內(nèi)外活性研究。3LMWCS對(duì)軟骨細(xì)胞的影響體外研究采用酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的方法研究LMWCS對(duì)補(bǔ)體替代途徑激活過(guò)程中補(bǔ)體蛋白3(complement 3,C3)沉積的影響；采用補(bǔ)體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞死亡的方法研究LMWCS通過(guò)抑制補(bǔ)體活性保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用；采用RT-PCR的方法研究替代途徑激活的情況下,LMWCS對(duì)軟骨細(xì)胞C3 mRNA水平的影響。4 LMWCS對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎的影響研究通過(guò)采用小鼠內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定(destabilization of the medial meniscus,DMM)的方法誘導(dǎo)建立OA模型。考察LMWCS通過(guò)口服給藥調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)緩解、治療OA的情況。利用測(cè)定小鼠后腿支撐力差值的方法考察小鼠OA的疼痛程度；利用番紅固綠染色對(duì)LMWCS緩解OA的程度進(jìn)行分析；利用ELISA和免疫組化的方法分別檢測(cè)小鼠體內(nèi)C5b-9的含量水平以及小鼠關(guān)節(jié)軟骨的C5b-9的含量。5基于近紅外光譜分析技術(shù)的CS抗補(bǔ)體活性篩選方法的建立收集不同來(lái)源、不同相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的CS樣品。采用漫反射的方式采集近紅外光譜,利用溶血法測(cè)定樣品抑制替代途徑補(bǔ)體活性的IC50。通過(guò)利用因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法優(yōu)選最佳預(yù)處理方法,利用無(wú)信息變量消除(uninformativevariable elimination, UVE),競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)加權(quán)采樣(competitive adaptive reweighted sampling,CARS)和隨機(jī)蛙跳(rondom frog)的方法選擇有效信息建立偏最小二乘(partial least square,PLS)回歸模型,采用預(yù)測(cè)集均方根誤差(root-mean-squares error of prediction,RMSEP)、相對(duì)分析誤差(residual predictive deviation,RPD)等參數(shù)對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究結(jié)果1 LMWCSs的制備及表征采取氧化降解法、酶解法、酸降解法以及微波輔助堿降解法對(duì)鯊魚來(lái)源、豬來(lái)源和牛來(lái)源的CS進(jìn)行降解共獲得12種LMWCSs。FTIR結(jié)果顯示LMWCSs和CS的骨架結(jié)構(gòu)一致；采用HPLC進(jìn)行雙糖分析,結(jié)果表明不同來(lái)源的雙糖組成不同,同種來(lái)源的CS和LMWCS組成相同,不同的降解方法對(duì)硫酸根的損失不同,酸降解和微波輔助堿降解的硫酸根丟失嚴(yán)重,氧化降解和酶降解對(duì)硫酸根含量影響不大；采用紫外分析表明酶解法產(chǎn)生的LMWCSs含有不飽和糖醛酸結(jié)構(gòu)；NMR結(jié)果表明酶降解法的LMWCSs的非還原端產(chǎn)生了不飽和糖醛酸,而其它LMWCSs的非還原端結(jié)構(gòu)與未降解的CS一致；分子排阻色譜-多角度激光散射測(cè)定LMWCSs的重均相對(duì)分子質(zhì)量(廚w)的結(jié)果表明,通過(guò)利用不同的方法制備了廚w在1217 Da到8085 Da的LMWCSs.2不同LMWCSs的抗補(bǔ)體活性研究與構(gòu)效關(guān)系對(duì)LMWCSs的結(jié)構(gòu)和活性之間的關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明,利用鯊魚來(lái)源的CS采用氧化降解的方法制備的LMWCS(LMWCS-S-O)具有更好的抗補(bǔ)體活性。對(duì)于LMWCSs與抗補(bǔ)體活性進(jìn)行構(gòu)效分析表明：△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S雙糖結(jié)構(gòu)有利于提高LMWCS的抗補(bǔ)體活性,而△Di-6S和△Di-OS不利于提高抗補(bǔ)體活性。LMWCS-S-O在緩解、治療OA中可能具有更好的療效。并且選擇出具有較好活性的LMWCS-S-O和較低活性的豬來(lái)源CS(CS-P)進(jìn)行進(jìn)一步的活性研究。3 LMWCS對(duì)軟骨細(xì)胞的影響采用ELISA的方法研究LMWC S對(duì)補(bǔ)體替代途徑激活過(guò)程中C3沉積的結(jié)果表明,LMWCS-S-O在400 μg/mL時(shí)可以顯著性地抑制C3b的產(chǎn)生,從而抑制替代途徑激活。而豬來(lái)源CS(CS-P)在1.2mg/mL時(shí)才顯著性的抑制替代途徑；對(duì)提取的軟骨細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和阿利新藍(lán)染色結(jié)果表明軟骨細(xì)胞提取正確；MTT實(shí)驗(yàn)表明在500 μg/mL的濃度下,LMWCS-S-O和CS-P對(duì)軟骨細(xì)胞并沒(méi)有毒性；補(bǔ)體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明400 μg/mL的LMWCS-S-O可以顯著性地抑制補(bǔ)體活性保護(hù)軟骨細(xì)胞；RT-PCR的結(jié)果表明,LMWCS-S-O可以顯著性地抑制由脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞C3mRNA水平,從而抑制軟骨細(xì)胞的C3表達(dá)水平。4 LMWCS對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨性關(guān)節(jié)炎的影響通過(guò)利用DMM的方法成功的建立了小鼠OA模型；小鼠支撐力結(jié)果表明LMWCS-S-O可以顯著性地緩解OA帶來(lái)的疼痛。番紅固綠染色結(jié)果表明LMWCS-S-O可以減少小鼠骨關(guān)節(jié)表面軟骨的損失,緩解OA的進(jìn)程；ELISA和免疫組化的結(jié)果表明LMWCS-S-O可以抑制C5b-9的水平,其可以通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性實(shí)現(xiàn)緩解、治療OA的作用。CS-P同樣表現(xiàn)出了緩解OA的效果,但作用不顯著。5基于近紅外光譜分析技術(shù)的硫酸軟骨素抗補(bǔ)體活性快速篩選方法的建立通過(guò)漫反射方式采集了60個(gè)不同來(lái)源、不同Mw的CS樣品的光譜,并利用溶血法測(cè)定其一級(jí)數(shù)據(jù)(IC50)；利用因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選擇了一階導(dǎo)數(shù)-SNV-SG亞滑-MC的最佳預(yù)處理方法；利用CARS法選擇了47個(gè)變量建立PLS模型；模型的校正集的相關(guān)系數(shù)Rc=0.983,驗(yàn)證集的相關(guān)系數(shù)Rp=0.969,驗(yàn)證集的RMSEP=0.376 mg,RPD=5.46,建立的模型可以用于CS的抗補(bǔ)體活性篩選。結(jié)論和意義通過(guò)本研究制備了一系列的LMWCSs,研究了LMWCSs與抗補(bǔ)體活性之間的構(gòu)效關(guān)系,揭示△Di-2,6diS,△Di-4,6diS和△Di-6S雙糖結(jié)構(gòu)有利于提高LMWCS的抗補(bǔ)體活性,在緩解、治療OA中可能具有更好的效果。并對(duì)LMWCS-S-O通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性緩解OA進(jìn)行了體外、體內(nèi)的初步探索,證明鯊魚來(lái)源LMWCS具有通過(guò)調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)防治OA的潛在的藥用價(jià)值。最后建立CS抗補(bǔ)體活性的快速篩選方法,有利于實(shí)現(xiàn)CS抗補(bǔ)體活性的快速篩選。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943;R96
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本文編號(hào)：2489017