【摘要】：近年來,PRKAR1A被越來越多的研究者所關注,因為其失活性突變可以導致以心臟粘液瘤和內分泌系統(tǒng)多發(fā)腫瘤為主要臨床表現(xiàn)的Carney綜合征的發(fā)生,所以被廣泛認為是一個抑癌基因。動物實驗已經(jīng)證明,PRKAR1A的突變可以導致多種內分泌系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。同時越來越多的證據(jù)表明,雖然PRKAR1A在非家族性內分泌系統(tǒng)腫瘤的患者中基因突變的發(fā)生率并不高,但其在轉錄和翻譯水平發(fā)生的表達水平下調也在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起到一定作用,目前具體機制尚未明確。PRKAR1A的表達下降會導致PKA活性的異常升高,從而激活PKA通路,因此我們認為PRKAR1A-PKA通路的變化有可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到一定作用。為驗證PRKAR1A-PKA通路在心臟粘液瘤和內分泌系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用,我們分別在個體水平(家族性心臟粘液瘤)、整體水平(19例心臟粘液瘤分析)和細胞水平(乳腺癌細胞系)進行分析,并對其致病機制做初步探討。目的:分析、并證明PRKAR1A-PKA在腫瘤發(fā)生過程中的作用,并探討其機制。方法:(1)由PRKAR1A剪切位點突變導致Carney綜合征家系的臨床及基礎研究1)通過對家系成員臨床資料和遺傳學資料的研究,了解疾病在家系中的發(fā)病頻率和遺傳學特點。2)通過外顯在捕獲測序技術對先證者血樣標本進行測序,并對所得結果進行分析,通過對SNPs和In Dels位點的分析,確定疾病的責任基因,并分析其可能對PRKAR1A轉錄翻譯的影響。3)抽取全部家系成員外周血,根據(jù)上一步實驗找到的可疑位點上下游設計引物,進行一代測序,并將測序結果與家系遺傳學特點相比較,驗證可疑突變位點是否導致疾病。4)應用逆轉錄PCR技術在m RNA水平分析突變位點對PRKAR1A轉錄的影響。5)在先證者腫瘤組織中檢測PRKAR1A表達情況,分析突變位點對翻譯的影響。(2)PRKAR1A在心臟粘液瘤中的作用及機制研究1)共收集19例非家族性非Carney綜合征的心臟粘液瘤患者的粘液瘤標本。2)對19例粘液瘤樣本中PRKAR1A的m RNA水平進行半定量檢測,分析PRKAR1A在非家族性非Carney綜合征的心臟粘液瘤患者腫瘤中的轉錄情況。3)應用Western blot方法檢測在心臟粘液瘤中PRKAR1A蛋白的表達水平,同時應用PRKAR1A的C端抗體和N端抗體,初步判斷是否存在結構異常。4)應用Western blot方法檢測CREB和ATF2蛋白的表達水平,并通過其磷酸化程度的變化評估其與PRKAR1A-PKA之間的聯(lián)系。5)對7例心臟粘液瘤患者粘液瘤的PRKAR1A基因進行目的外顯子捕獲測序,并對突變位點應用一代測序在腫瘤組織和外周血中進行驗證。(3)PRKAR1A-PKA通路在乳腺癌中的作用及機制研究1)應用Western blot方法檢測6組乳腺癌樣本中PRKAR1A表達情況。2)驗證依托泊苷在體外對人乳腺癌細胞系的殺傷作用,并通過MTT確定依托泊苷的工作濃度和工作時間。3)應用Westurn blot方法檢測CREB磷酸化程度,確定PKA抑制劑H89和PKA激活劑Forskolin的工作濃度和工作時間。4)通過檢測不同時間點CREB和ATF2的磷酸化程度,明確PKA激活劑Forskolin對CREB和ATF2活化程度的影響。5)分別加入H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制劑,明晰PKA、PKC通路對人乳腺癌細胞對依托泊苷敏感性的影響。6)提取細胞核蛋白,檢測H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制劑對CREB和ATF2活化入核的影響。7)揭示H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制劑對BCL2表達水平的影響。結果:(1)由PRKAR1A剪切位點突變導致的Carney綜合征家系的臨床及基礎研究1)家系圖和臨床癥狀表明,整個家系中先證者和母親可被確診為Carney綜合征。2)通過外顯子捕獲測序,我們共確定了130個SNPs位點和3個插入/刪除突變位點。其中3個In Del位點均可引起移碼突變,包括NF1的第55外顯子(c.8075dup G),PRKAR1A第六外顯子(c.549+1del G)和RECQL1第15內含子(c.2297-1del G)。根據(jù)文獻報道,我們認為PRKAR1A第六外顯子(c.549+1del G)是本家系的致病基因。3)一代測序結果表明,先證者和母親發(fā)生突變,突變形式完全一樣,而父親和哥哥的測序樣本中均未發(fā)現(xiàn)突變。突變結果與臨床表現(xiàn)完全符合。4)逆轉錄PCR結果顯示,母親和先證者的樣本中發(fā)現(xiàn)了包含未剪切的第六內含子的m RNA。對PCR產物的堿基序列進行分析后證明,該家系中的PRKAR1A突變可以在翻譯時在185號纈氨酸后發(fā)生移碼突變,在繼續(xù)編碼9個新的氨基酸后提前出現(xiàn)終止子TGA。5)Western blot結果顯示,先證者的粘液瘤組織中PRKAR1A分子量正常,但在粘液瘤組織中PRKAR1A的表達量與對照組(正常心肌組織)相比明顯下降(P0.05)。說明變異的m RNA未被翻譯。產生疾病的原理是無意義m RNA降解作用導致的PRKAR1A表達下降。(2)PRKAR1A在心臟粘液瘤中的作用及機制研究1)PRKAR1A的m RNA水平在心臟粘液瘤中明顯降低。2)PRKAR1A蛋白在心臟粘液瘤中含量明顯減少(包括C端和N端抗體結果)。3)p CREB/CREB和p ATF2/ATF2在腫瘤組織中表達均明顯升高。4)CREB磷酸化水平的升高與PRKAR1A的表達下調呈弱相關,但沒有統(tǒng)計學意義。5)超過21%的非家族性心臟粘液瘤存在PRKAR1A失活性突變率,超過54%的非家族性心臟粘液瘤PRKAR1A表達下降與PRKAR1A失活性突變有關,并且這種突變是腫瘤組織特有的,在外周血中并未發(fā)現(xiàn),可能是心臟粘液瘤發(fā)生的主要原因。(3)PRKAR1A-PKA通路在乳腺癌中的作用及機制研究1)乳腺癌組織中的PRKAR1A突變率不高,但與癌旁組織相比乳腺癌樣本中PRKAR1A表達明顯下降(P=0.024)。2)依托泊苷在體外對MDA-MB-231、MCF7細胞系殺傷作用明確,最佳工作條件分別為200 n M(24小時)和500 n M(12小時)3)給予PKA激活劑或抑制劑可以改變CREB磷酸化水平,PKA抑制劑H89工作條件為2μM,1小時,PKA激動劑Forskolin工作條件為2μM,2小時。4)PKA激動劑Forskolin處理乳腺癌細胞后,p CREB/CREB呈逐漸升高趨勢,p ATF2/ATF2呈先升高后下降趨勢,其中p ATF2(Thr 71)/ATF2達到最高點時間要比p ATF2(Thr52)/ATF2晚。5)依托泊苷對乳腺癌細胞的殺傷作用可以被PKA抑制劑增強,也可以被PKA激活劑減弱。但是Forskolin對細胞的保護作用可以部分被PKC抑制劑拮抗。6)PKA活性增加可以使核內CREB和ATF2水平增加。其中ATF2的增加可被PKC抑制劑拮抗,并且增加乳腺癌細胞系對依托泊苷的敏感性。7)PKA的活性增高可以使BCL2表達增多,這種增多可能是激活的ATF2介導的,并可以被RO31-8220部分拮抗。結論:總之,PRKAR1A是一個抑癌基因,各種原因導致的其失活性突變或表達下調均可能導致遺傳性疾病以及是多種腫瘤的發(fā)生。PRKAR1A表達下調會導致PKA活性的異常升高,通過直接激活CREB和間接激活(AKT、ERK、PKC)ATF2促進其向細胞核內轉移激活其下游基因如BCL2的表達,并增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性,可能在心臟粘液瘤、乳腺癌及其他內分泌系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：2479926