【摘要】：在人類生產(chǎn)生活中,濫用抗生素引起了細(xì)菌抗藥性的增強(qiáng),導(dǎo)致產(chǎn)生了超級(jí)耐藥細(xì)菌。其典型例子是,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)和耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus, VRE)的爆發(fā)。MRSA是一種最致命的超級(jí)耐藥細(xì)菌,它能導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血癥等疾病。從發(fā)現(xiàn)至今,MRSA感染幾乎遍及全球,已成為醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)感染的重要病原菌之一。VRE屬于腸球菌屬,對(duì)多種抗生素均有耐藥性,尤其是萬古霉素。VRE的感染也造成許多致命的健康問題,如多器官功能障礙綜合征(multiorgan dysfunction syndrome, MODS)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),失血性休克和肺炎等。由此可見目前人類迫切需要開發(fā)更有效的新型抗菌劑來治療MRSA和VRE的感染。近年來,蝎毒液已被證明是一個(gè)豐富的抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPS)的來源。抗菌肽在新的抗菌藥物開發(fā)研究中備受關(guān)注,因?yàn)樗梢詺⑺蓝嘀啬退幮圆≡��？咕木哂袕V譜抗菌活性、不易產(chǎn)生耐藥性和毒性低等特點(diǎn)。目前,已發(fā)現(xiàn)至少60多種蝎毒素抗菌肽。實(shí)驗(yàn)證明,這些抗菌肽均可以殺死革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、真菌、病毒和腫瘤細(xì)胞。我們采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,從非洲黃爪蝎(Opistophthalmw glabrifrons)毒腺cDNA文庫中隨機(jī)挑選了80個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序。除去低質(zhì)量的序列,共獲得了66條有效序列進(jìn)行分析。其中38個(gè)克隆子編碼毒素多肽,28個(gè)克隆子編碼細(xì)胞蛋白(非毒素)。對(duì)這些新毒素多肽進(jìn)行序列分析得到19個(gè)新多肽(包含2個(gè)鉀毒素、1個(gè)陰離子多肽和16個(gè)抗菌肽)。根據(jù)這些多肽的序列同源性,我們將獲得的多肽分為4個(gè)不同的家族：蝎短鏈鉀離子通道毒素(Short-chain potassium channel toxins, ScKTxs)、蝎長(zhǎng)鏈鉀離子通道毒素(Long-chain potassium channel toxins, LcKTxs)、蝎抗菌肽(Antimicrobial peptides)和蝎陰離子多肽(Acidic peptides)。其中抗菌肽豐度最高,總共獲得了16個(gè)新的抗菌肽。我們鑒定到了1個(gè)陰離子多肽,命名為Osa-1。Osa-1的前體由76個(gè)氨基酸殘基組成,信號(hào)肽和成熟肽分別由24、52個(gè)氨基酸殘基組成。在毒素多肽序列中鑒定到的鉀毒素有2個(gè),其中一個(gè)為長(zhǎng)鏈鉀毒素(OsKTx-1),一個(gè)為短鏈鉀毒素(OsKTx-2)我們對(duì)從非洲黃爪蝎毒腺中分離出的一個(gè)新的抗菌肽Opisin進(jìn)行了功能研究。Opisin前體由22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽、19個(gè)氨基酸殘基的成熟肽和35個(gè)氨基酸殘基的前肽組成。它是一種陽離子兩親性α-螺旋分子。多序列同源性分析結(jié)果表明,Opisin與從Mesobuthus eupeu中分離的Meucin-18、Mesobuthus gibbosus中分離的Megicin-18、 Mesobuthus martensii中分離的Marcin-18、Isometrus maculate中分離的Imcroporin、 Androctonus crassicauda中分離的AcrAP2、Tityus Costatus中分離的Clone5和Clone6的同源性為42.1～15.8%之間。Opisin還與從Mesobuthus martensii Karsch中分離的Bmkb1和Bmkb2、Androctonus amoreuxi中分離的AamAP1和AamAP2、Androctonus crassicauda中分離的AcrAP1、T. Costatus中分離的Clone4、Tityus serrulatus中分離的TsAP-1和TsAP-2、Chaerilus Tricostatus中分離的Ctriporin、Lychas mucronatus中分離的Mucroporin有15.0～5.3%的同源性。Opisin對(duì)5種革蘭氏陽性菌的抗菌活性分別進(jìn)行檢測(cè)(i)S. Aureus (AB 94004), (ii) Bacillus megaterium (AB 90008), (iii) Bacillus thuringiensis (AB 93100), (iv) Nocardia corallina (AA 92100), 和(v) Micrococcus luteus (AB 2010179)。我們發(fā)現(xiàn)Opisin能夠有效地抑制S. Aureus和N. corallina生長(zhǎng),其MICs值分別為4.0和4.0μM。Opisin對(duì)B. Thuringiensis (MIC 6.0μM), M. Luteus (MIC 8.0 μM)和B. Megaterium (MIC 10.0 μM)具有較弱的抗菌活性。我們同樣測(cè)試了Opisin對(duì)7個(gè)革蘭氏陰性菌的抗菌活性(i) E. coli DH5a, (ii) Pseudomonas putida, (iii) Pseudomonas aeruginosa (AB 93066), (iv) Enterobacter cloacae (AB2010162), (v) Klebsiella oxytoca (AB 2010143), (vi) Pseudomonas fluorescens, (vii) Salmonella enterica (AB 2010185)和(viii)真菌Candida tropicalis AY91009。我們發(fā)現(xiàn)Opisin對(duì)E. coli DH5a, P. Putida和P. aeruginosa AB 93066具有中等的抗菌活性,MIC值分別為20.0、20.0和20.0μM。然而,抗菌肽Opisin的濃度為少于等于38.2μM時(shí),對(duì)E. Cloacae、. S. Enterica、K. Oxytoca和P. Fluorescens沒有明顯的抗菌活性。抗菌肽Opisin還能有效抑制真菌C. tropicalis AY 91009的生長(zhǎng),MIC值為20.0μM。因此,Opisin對(duì)革蘭陽性菌的抗菌活性高于革蘭陰性菌。有趣的是,Opisin能夠有效抑制多重耐藥菌的生長(zhǎng),如對(duì)耐甲氧西林菌株MRSA和耐萬古霉素腸球菌菌株VRE。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Opisin對(duì)Sau有很強(qiáng)的抗菌活性,其MIC值為2.0μM；它同樣對(duì)被測(cè)試的其他耐甲氧西林菌株有很強(qiáng)的抗菌活性,包括16436、16465、16558、16559、16585和16760,其MIC值均為4.0 μM。Opisin對(duì)耐萬古霉素腸球菌菌株也有很強(qiáng)的抗菌活性,對(duì)菌株E147、E161、E179、S13、E11、E128和E156的MIC值分別為4.0、4.0、4.0、4.0、6.0、6.0和6.0μM。因此,Opisin能用于有關(guān)治療MRSA以及VRE感染的藥物開發(fā),為棘手的人類耐藥菌引起的疾病的治療提供新的思路。以O(shè)pisin為模板,選取影響抗菌肽抑菌活性的凈電荷和疏水性這兩個(gè)重要參數(shù)為改變對(duì)象,設(shè)計(jì)一系列的抗菌肽,進(jìn)一步測(cè)定它們的抑菌活性,總結(jié)電荷、疏水性與肽抗菌活性之間的規(guī)律。母肽Opisin的兩個(gè)丙氨酸(A)均替換成具有強(qiáng)疏水性的亮氨酸(L),合成出抗菌肽Opisin_M1。同時(shí),把母肽Opisin的較弱疏水性的兩個(gè)甲硫氨酸(M)替換成較強(qiáng)疏水性的亮氨酸(L),合成出抗菌肽Opisin_M2�？咕鷮�(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Opisin_M2對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抗菌活性。在試驗(yàn)的革蘭氏細(xì)菌之中,Opisin_M2對(duì)Staphylococcus aureus AB 94004, Nocardia corallina AA 92100, Bacillus thuringiensis AB93100和Micrococcus luteus AB 2010179有顯著的抑菌效果,最小抑菌濃度均為4.0μM。Opisin_M3是通過將Opisin α-螺旋結(jié)構(gòu)的極性面中的甘氨酸(G)、色氨酸(W)和絲氨酸(S)均替換成具有正電荷的賴氨酸(K),非極性面不變?cè)O(shè)計(jì)而成的衍生肽。Opisin_M4是通過將Opisin α-螺旋結(jié)構(gòu)的極性面中的色氨酸(W)替換成具有正電荷的賴氨酸(K)非極性面不變?cè)O(shè)計(jì)而成的衍生肽。Opisin_M5是通過將Opisin α-螺旋結(jié)構(gòu)的極性面中的色氨酸(W)和絲氨酸(S)均替換成具有正電荷的賴氨酸(K),非極性面不變?cè)O(shè)計(jì)而成的衍生肽�？咕鷮�(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Opisin_M4和Opisin_M5對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抗菌活性。在試驗(yàn)的革蘭氏細(xì)菌之中,Opisin_M4和Opisin_M5對(duì)Micrococcus luteus AB 2010179, Bacillus megaterium AB 90008和Escherichia coli DH5a有顯著的抑菌效果,最小抑菌濃度都分別為4.0 μM、4.0 μM和8.0μM。最后我們把Opisin抗菌肽分子疏水面的疏水性比較低的丙氨酸(A)替換成疏水性最強(qiáng)的異亮氨酸(I),合成衍生肽Opisin_M6。再以O(shè)pisin作為模板,刪除S尾巴,合成衍生肽Opisin_M7。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Opisin_M6和Opisin_M7對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抗菌活性。在試驗(yàn)的革蘭氏細(xì)菌之中,Opisin_M6和Opisin_M7都對(duì)Nocardia corallina AA 92100, Bacillus thuringiensis AB93100和Escherichia coli DH5a有顯著的抑菌效果,最小抑菌濃度都分別為4.0 μM、4.0μM和8.0μM。此外,衍生肽Opisin_M3、Opisin_M4和Opisin_M5在活性濃度范圍內(nèi)溶血率低于10%。綜上,肽的抑菌活性與肽的疏水性、凈電荷數(shù)量以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)密切相關(guān)。通過序列同源性搜索從Centruroides exilicauda基因組序列篩選到一個(gè)新的抗菌肽CeAP1。CeAP1前體由22個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽序列,17個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽序列以及35個(gè)氨基酸殘基組成的前肽序列組成。CeAP1與其它蝎源陽離子短鏈抗菌肽序列同源性范圍是82%～42%�？咕V結(jié)果顯示CeAP1主要作用于革蘭氏陽性菌,其對(duì)耐藥菌MRSA和VRE的MIC值在16～32μM之間。CeAP1溶血活性適中,對(duì)人紅細(xì)胞的Hc50為52μM。分子進(jìn)化分析結(jié)果顯示短鏈陽離子抗菌肽普遍存在于不同蝎種毒液中,CeAP1與其它來源于新大陸蝎種多肽聚在一起,表明短鏈陽離子抗菌肽基因出現(xiàn)在蝎毒液的時(shí)間早于新世界和舊世界蝎種物種分歧時(shí)間。氨基酸位點(diǎn)選擇壓力分析結(jié)果顯示,蝎短鏈陽離子抗菌肽基因整體存在很強(qiáng)的進(jìn)化選擇,不同方法共檢測(cè)到兩個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)和一個(gè)正選擇位點(diǎn)。這些位點(diǎn)為設(shè)計(jì)新的抗菌肽突變體提供了新的理論基礎(chǔ)和分子依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國地質(zhì)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R914

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本文編號(hào)：2451064