發(fā)布時間：2019-03-29 20:49

【摘要】：1. TRAIL-NC1和TRAIL-TD融合蛋白的設(shè)計與復性 腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導配體(TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族的一員,由于其能選擇性殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無害而被視為有潛力的抗腫瘤蛋白藥物。TRAIL能通過與腫瘤細胞細胞表面的死亡受體結(jié)合,從胞外途徑傳遞死亡信號,最終誘導細胞凋亡。然而,目前常見的一些重組TRAIL均存在同樣的問題：不穩(wěn)定和半衰期短。 為了克服這些問題,研究者們制備了許多帶標簽的重組TRAIL融合蛋白,如His-TRAIL, Flag-TRAIL, LZ-TRAIL和iLZ-TRAIL,旨在增強TRAIL的穩(wěn)定性和活性,另外也是為了純化方便的考慮。遺憾的是,雖然這些TRAIL融合蛋白表現(xiàn)出極強的腫瘤細胞誘導凋亡能力,同時卻也引起了肝毒性。由于帶有外源標簽的TRAIL同時帶有毒副作用,因此有研究者采用內(nèi)源的融合片段(human pulmonary surfactant-associated protein D)來制備具有雙重功能和更高凋亡活性的TRAIL融合蛋白。綜上,尋找內(nèi)源性雙功能片段作為TRAIL的融合伴侶,有望解決TRAIL半衰期短、穩(wěn)定性差和肝毒性等缺點。 在本章節(jié)中,我們利用來源于人膠原蛋白ⅩⅤⅢ的NC1和NC1中的三聚域(TD),設(shè)計了兩種全新的TRAIL融合蛋白：TRAIL-NC1和TRAIL-TD,并且在大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達。由于兩種融合蛋白都以不溶的包涵體形式存在于大腸桿菌中,且傳統(tǒng)的復性方法難以對它們進行成功復性,因此我們開發(fā)了新的復性方法——兩步復性法,它結(jié)合了稀釋復性和凝膠過濾法柱上復性的優(yōu)點,分步復性融合蛋白,最終成功復性了TRAIL-NC1融合蛋白。 分子排阻色譜分析TRAIL-NC1融合蛋白表明它的存在形式為三聚體,而TRAIL-TD融合蛋白為六聚體。TRAIL-NCI融合蛋白的誘導腫瘤細胞凋亡活性與同樣方法復性后的TRAIL (114-281)相同,然而大大弱于可溶性的TRAIL(114-281)(活性強50倍左右),仍未滿足最初設(shè)計TRAIL-NC1的要求。因此,本章節(jié)最主要的貢獻為開發(fā)了新的兩步復性法,豐富了蛋白質(zhì)復性領(lǐng)域的方法,對于TRAIL存在的缺點,仍需繼續(xù)設(shè)計不同的解決方案。 2. TRAIL-vcMMAE的設(shè)計與抗腫瘤活性研究 TRAIL三聚體通過與細胞表面的死亡受體DR4和DR5結(jié)合傳遞死亡信號,從而誘導細胞凋亡。誘捕受體(DcR1和DcR2)和可溶性受體(OPG)由于只含有部分或不含死亡域(death domain, DD)而不能傳遞TRAIL的凋亡信號。然而,仍然存在一些腫瘤細胞,其細胞表面表達DR4和DR5,卻仍然對TRAIL耐受,比如許多乳腺癌細胞系和黑色素瘤細胞系。研究者們認為細胞內(nèi)TRAIL信號通路上一些事件導致了上述現(xiàn)象,例如FADD和caspase8存在缺陷、cFLIP過表達等原因。TRAIL可以通過與死亡受體結(jié)合被細胞內(nèi)吞,同時該內(nèi)吞行為并不是TRAIL誘導凋亡所必需的。因此,為了克服表面表達有DR4和DR5死亡受體的腫瘤細胞對TRAIL的耐受性,我們利用這一內(nèi)吞過程來使TRAIL通過化學偶聯(lián)攜帶劇毒小分子藥物進入細胞內(nèi),細胞內(nèi)溶酶體中的多種蛋白酶能夠水解偶聯(lián)物從而釋放出劇毒小分子,以另外的途徑誘導細胞凋亡。 我們選擇了海兔毒素衍生物MMAE用于偶聯(lián)TRAIL,它們通過一個二肽(valine-citrulline,vc) linker相連接。MMAE是一種人工合成的有絲分裂抑制劑,它能通過抑制微管蛋白二聚化阻滯細胞分裂,從而使細胞凋亡。vcMMAE是一個在細胞外穩(wěn)定的系統(tǒng),而當它進入細胞后,可經(jīng)溶酶體中組織蛋白酶B的水解,釋放出MMAE,發(fā)揮抑制有絲分裂的機制。 在本章的研究中,我們設(shè)計了兩種TRAIL(95-281)突變體(S96C和N109C)用于偶聯(lián)vcMMAE,并且從體外活性實驗中選出活性更優(yōu)的N109C-vcMMAE進行后續(xù)的研究。后續(xù)的實驗表明N109C-vcMMAE在腫瘤細胞攝取、死亡受體親和力、內(nèi)吞、體內(nèi)靶向等方面有良好的表現(xiàn),初步證實了TRAIL-MMAE偶聯(lián)物在抗腫瘤方面的可行性,進而拓寬了抗體偶聯(lián)藥物(ADC)的覆蓋范圍,使TRAIL能夠替代抗體成為ADC中的“靶向彈頭”部分。 3.一種突變Cys位點特異性PEG修飾TRAIL的方法及其產(chǎn)物的抗腫瘤活性研究 在小鼠腫瘤移植模型中,無論是TRAIL單獨用藥還是與化療藥物聯(lián)用,都展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。然而,在2011年,Amgen和Genentech先后將TRAIL(產(chǎn)品名：Dulanermin)從公司產(chǎn)品線上撤下,且未發(fā)布具體緣由�？赏茰y的是TRAIL本身的一些缺點制約了其在臨床上的進一步進展,比如：半衰期短、穩(wěn)定性差和潛在肝毒性。Polyethylene glycol (PEG)是一種生物相容性極佳的高分子聚合物,PEG修飾也被公認為是最成功的蛋白修飾方式之一,經(jīng)過PEG修飾的蛋白具有更長的半衰期、更好的穩(wěn)定性以及更低的免疫原性。美國食品藥物監(jiān)督管理局(American Food and Drug Administration, FDA)至今已批準了諸多經(jīng)PEG修飾的蛋白藥物和酶類,比如,用于治療急性淋巴細胞白血病和其他淋巴瘤的PEG-天冬酰胺酶(商品名：Oncaspar),用于治療急性聯(lián)合免疫缺陷癥的PEG腺苷脫氨酶(商品名：Adagen)。因此,研究者利用PEG修飾來改善TRAIL的藥代動力學特性和穩(wěn)定性也就是意料之中的事情了。由于N端的氨基比側(cè)鏈氨基殘基具有更小的pKa值,只要控制反應條件就能實現(xiàn)特異性地跟N端氨基的反應,因此之前的研究者們均采用N端特異性PEG修飾的方法。但是該方法所需時間較長、效率較低,因此需要我們找到一種更為簡便、高效的PEG修飾TRAIL的方式。 在本章中,我們描述了一種新型PEG-TRAIL的制備、分析和活性評價過程,它為在突變Cys位點進行PEG修飾的TRAIL (95-281)突變體。我們選擇單甲基化聚(乙二醇)馬來酰亞胺(mPEG-MAL)用于修飾TRAIL,因為馬來酰亞胺基團能快速與TRAIL突變體上還原后的半胱氨酸巰基(Cys-SH)反應生成硫醚鍵。我們選擇N109C作為反應的TRAIL(95-281)突變體,原因在于N109C突變了一個潛在的N-糖基化位點(Asn-109)且在第三章中成功偶聯(lián)了MMAE,并展現(xiàn)出很好的抗腫瘤活性。在本章的研究中,我們在突變Cys-SH定點PEG修飾TRAIL(95-281)突變體N109C (mPEGMAL-N109C)的體內(nèi)外活性、穩(wěn)定性、藥代動力學性質(zhì)等方面進行了深入研究。同時,我們構(gòu)建了N-端直接特異性PEG修飾的TRAIL(114-281)(mPEGALD-TRAIL114-281),用于與mPEGMAL-N109C比較,作為傳統(tǒng)PEG定點修飾方式的對照。結(jié)果顯示,相比野生型TRAIL(114-281)和mPEGALD-TRAIL114-281,mPEGMAL-N109C表現(xiàn)出更高的體內(nèi)抗腫瘤活性、更好的穩(wěn)定性、更長的半衰期,同時沒有檢測到任何的肝腎毒性,表明突變Cys位點的特異性PEG修飾可以成為修飾TRAIL一種更好選擇。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R91;R96
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本文編號：2449873