【摘要】：生物膜系統(tǒng)具有阻擋外源傷害,維持生命活動穩(wěn)定、有序進(jìn)行的功能。生物膜系統(tǒng)作為生物體的外層結(jié)構(gòu),為生命活動的進(jìn)行提供必要的能量、信息、物質(zhì)的交換。生物膜系統(tǒng)的選擇性通透能力為生物體提供交換途徑的同時也起到保護(hù)作用。對于作用靶點(diǎn)在胞內(nèi)的藥物,其發(fā)揮作用的先決條件是要穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。然而生物膜的屏障作用阻止了許多藥物的滲透,從而很大程度上限制了這類藥物分子的生物利用率。因而,生物膜滲透能力成為藥物篩選的重要研究內(nèi)容。近三十年間,生物膜系統(tǒng)的功能性與藥物滲透性研究由復(fù)雜的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)逐漸發(fā)展到體外實(shí)驗(yàn)。體外模型涵蓋了計算機(jī)模擬、分子水平、人工膜水平、細(xì)胞水平、組織水平實(shí)驗(yàn)等諸多方式。然而在滲透性檢測方法上的突破十分有限,目前的研究報道大多基于熒光標(biāo)記、電學(xué)信號檢測等模式。然而部分熒光標(biāo)記分子對細(xì)胞功能可能具有一定的影響,且熒光修飾改變了藥物分子的原有結(jié)構(gòu),難以在接近真實(shí)環(huán)境中進(jìn)行藥物滲透能力的檢測。電學(xué)信號檢測的芯片結(jié)構(gòu)和設(shè)備較為復(fù)雜,電極容易受到污染,方法重現(xiàn)性較差。為克服現(xiàn)有研究方法的缺點(diǎn),本論文旨在建立一種非標(biāo)記光學(xué)檢測方法,用于生物膜功能和藥物滲透性的研究。論文構(gòu)建了基于硅納米孔陣列的支撐人工生物膜系統(tǒng),利用硅納米孔陣列的微結(jié)構(gòu)和反射干涉光學(xué)現(xiàn)象研究了人工生物膜系統(tǒng)對納米孔的封閉效應(yīng)。在所構(gòu)建的光學(xué)傳感平臺上研究了離子通道蛋白對氫離子的選擇性通透功能,同時研究了肽類物質(zhì)的跨膜行為,以及藥物分子跨越內(nèi)皮細(xì)胞的能力。上述研究工作為非標(biāo)記光學(xué)傳感器應(yīng)用于藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。本論文的主要內(nèi)容如下：(1) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列-水凝膠復(fù)合材料支撐型人工細(xì)胞膜系統(tǒng),在H+敏感水凝膠的信號放大作用下,研究了復(fù)合材料在微環(huán)境下對H+的高靈敏傳感能力,采用微流控技術(shù)成功構(gòu)建了納米孔陣列支撐的磷脂雙分子層(Phospholipid bilayers, PLBs),傅里葉變換反射干涉光譜(Fourier transferred-reflectometric interference spectrum, FT-RIS)結(jié)果表明PLBs能有效阻斷溶液中的H+向納米孔陣列的擴(kuò)散。在PLBs中鑲嵌離子通道蛋白(短桿菌肽A)后,該人工細(xì)胞膜恢復(fù)了部分離子通透功能。在此基礎(chǔ)上研究了離子通道抑制劑的抑制作用,建立了離子通道靶向藥物篩選的模型。(2) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列表面支撐型人工細(xì)胞膜系統(tǒng),基于人工細(xì)胞膜對納米孔陣列表面非跨膜生物分子的封閉作用,建立了多肽跨越細(xì)胞膜過程的實(shí)時光學(xué)檢測方法,研究了TP2、Cecropin A、hIAPP、Dermaseptin等多種跨膜肽(Membrane-translocating peptides, MTPs)分子跨越細(xì)胞膜的動力學(xué)過程,建立了不同類型MTPs的區(qū)分模型,結(jié)果與真實(shí)微生物抗菌結(jié)果、真實(shí)細(xì)胞膜相互作用結(jié)果相吻合。最終建立了針對載體型MTPs和抗菌型MTPs的藥物篩選模型。(3) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列支撐的體外血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)系統(tǒng),基質(zhì)膠Matrigel(?)共培養(yǎng)狀態(tài)下成功實(shí)現(xiàn)了人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hBMECs的體外培養(yǎng)并形成了緊密連接結(jié)構(gòu)�；贐BB對納米孔陣列表面非滲透型分子的封閉作用,建立了體外BBB的非標(biāo)記光學(xué)檢測方法,研究了不同培養(yǎng)時間下體外BBB通透性的改變,用乙酰膽堿、熒光素鈉等模型分子驗(yàn)證了所構(gòu)建的體外模型。用該模型測試了氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素等多種抗生素對BBB的滲透能力,建立了腦外傷藥物的體外篩選模型。(4) 構(gòu)建了一種硅納米孔陣列表面固定微生物層的系統(tǒng),基于硅納米孔陣列的封閉效應(yīng),建立了微生物的非標(biāo)記分析方法。將特定抗體(E.Coli抗體)固定于納米孔陣列表面并捕獲E.Coli后,微生物層對納米孔陣列的分子通透產(chǎn)生阻礙作用。以BSA作為探針分子,通過測量不同封閉狀態(tài)下BSA對多孔層光學(xué)信號的變化,建立了用于微生物層密度定量分析的非標(biāo)記光學(xué)方法,上述方法在抗菌藥物篩選中具有潛在的應(yīng)用價值。(5) 論文的最后一章介紹了作者在美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院交流訪問期間所做的研究工作,建立了一種用于疾病診斷的比色陣列傳感器。該比色陣列對不同來源的尿液樣本能產(chǎn)生特征光學(xué)響應(yīng),利用成像系統(tǒng)和信息學(xué)圖像分析方法提取光學(xué)響應(yīng)信號,并利用統(tǒng)計學(xué)算法篩選出陣列式傳感的最優(yōu)化組成。在最優(yōu)化條件下實(shí)現(xiàn)了川崎病和普通發(fā)燒患者之間的區(qū)分,在訓(xùn)練組中靈敏度和特異性分別為0.94和0.91(其ROC AUC值達(dá)到0.981),測試組中則達(dá)到0.94和0.82 (ROC AUC值為0.873)。利用統(tǒng)計學(xué)算法進(jìn)行文獻(xiàn)信息挖掘并探討了該傳感器的作用機(jī)理。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R943
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本文編號：2438066