發(fā)布時間：2019-03-08 08:04

【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)疾病，包括神經(jīng)退行性疾病及腦部腫瘤等，嚴(yán)重危害人類健康。許多神經(jīng)退行性病變與基因的異常表達(dá)有關(guān)，基因藥物具有分子靶點的高特異性特點。因此，針對CNS疾病治療，高效、準(zhǔn)確的靶基因沉默技術(shù)具有很好的治療前景。 但是，由于血腦屏障（the blood brain barrier，BBB）的生理作用，包括基因藥物在內(nèi)的大多數(shù)大分子藥物無法主動轉(zhuǎn)運跨越BBB至腦內(nèi)，實現(xiàn)其有效治療作用。因此，構(gòu)建通過非侵襲給藥途徑如鞘內(nèi)注射，將基因藥物傳遞入腦的藥物載體系統(tǒng)至關(guān)重要。經(jīng)載體的包封，可以有效降低血液中核酸酶的影響從而提高藥物穩(wěn)定性。此外，特異性配體修飾的非病毒載體，可通過靜脈給藥途徑實現(xiàn)載藥系統(tǒng)主動轉(zhuǎn)運透過BBB，將藥物遞送至腦內(nèi)。 基于以上研究背景，本課題構(gòu)建了一種新型的陽離子聚合物PEG-P[Asp(TEP)]-chole作為基因載體，制備PEG-P[Asp(TEP)]-chole/pDNA聚陽離子復(fù)合物（Polyplxe）。由于天冬氨酸為構(gòu)成體內(nèi)蛋白的基本氨基酸，所以生物相容性較好，載體的安全性得到提高。進(jìn)而在聚陽離子復(fù)合物表面修飾了雙級靶向配體，由狂犬病毒糖蛋白衍生的多肽RVG29作為一級腦靶向配體，與BBB上的乙酰膽堿受體和γ-氨基丁酸受體特異性結(jié)合結(jié)合，以受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，實現(xiàn)主動靶向腦轉(zhuǎn)運。由Tet-1肽作為二級靶向配體與神經(jīng)節(jié)苷脂GT1B受體特異性結(jié)合靶向于神經(jīng)細(xì)胞。 第一部分，陽離子聚合物載體的合成及表征。 合成L-天冬氨酸-N-羧酸酐（BLA-NCA）單體，以BLA-NCA和聚乙二醇為原料合成PEG-PBLA嵌段聚合物。然后，對聚天冬氨酸鏈端進(jìn)行氨基修飾，使PEG-PBLA呈正電性，可與帶負(fù)電的基因壓縮形成納米聚陽離子復(fù)合物。進(jìn)一步將聚合物進(jìn)行膽甾醇修飾，得到PEG-P[Asp(TEP)]-chole，聚合物的疏水性增加，有利于粒子的生物膜的透過性能及穩(wěn)定性提高。 配體的連接利用乙縮醛與多肽結(jié)構(gòu)中半胱氨酸的巰基反應(yīng)。在醋酸緩沖液為介質(zhì)的酸性環(huán)境中，PEG末端的乙縮醛基水解為醛基，與含有半胱氨酸的多肽Tet1或RVG29反應(yīng)，得到經(jīng)配體修飾的聚合物Tet1-PEG-P[Asp(TEP)]-chole或者RVG29-PEG-P[Asp(TEP)]-chole。通過核磁氫譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，合成的終產(chǎn)物為PEG-P[Asp(TEP)]-chole，并且將多肽Tet1和RVG29修飾于PEG-P[Asp(TEP)]-chole之上。 第二部分，聚離子基因復(fù)合物的制備及表征。 制備不同N/P比的載重組質(zhì)粒復(fù)合物，測定其粒徑、Zeta電位并通過凝膠電泳考察其基因復(fù)合能力。結(jié)果顯示，隨N/P的增加，粒徑逐漸減小，至150nm以下，當(dāng)N/P比為12以上時，粒徑約100nm，有利于聚陽離子復(fù)合物透過BBB。Zeta電位結(jié)果顯示，隨N/P的增加，正電性逐漸增加，N/P比等于16時，Zeta電位約+15mV。凝膠電泳顯示，隨N/P比的增加，游離pDNA的條帶逐漸變淺，N/P比12時，條帶完全消失。說明隨著表面的正電荷逐漸增加，載體對pDNA的包封能力逐漸提高，而正電性的提高既有利于透過BBB（BBB內(nèi)皮細(xì)胞帶負(fù)電性），此外能夠提高轉(zhuǎn)染效率。 第三部分，聚離子基因復(fù)合物的細(xì)胞及組織毒性考察。 采用MTT法，以常用的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin-2000為陽性對照考察不同N/P比的聚陽離子復(fù)合物對bEnd.3細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示，不同N/P制備的復(fù)合物給藥后，兩種細(xì)胞生存率均在85%以上，而Lipofectamin-2000對照組的細(xì)胞生存率小于80%。結(jié)果表明，與lipofectamine-2000相比，PEG-P[Asp (TEP)]-chole具有較小的細(xì)胞毒性。CD68免疫組化考察PEG-P[Asp (TEP)]-chole的組織毒性。Balb/c小鼠尾靜脈給藥7d后，分別于24h和72h觀察主要器官中陽性細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，給藥24h后腎臟、肺、脾有少量的炎性細(xì)胞，其它組織與生理鹽水組相比，無顯著性差異。72h結(jié)果顯示，各組織中幾乎無陽性細(xì)胞，與生理鹽水組無顯著性差異。CD68免疫組化結(jié)果表明，PEG-P[Asp (TEP)]-chole對部分組織有一定的急性毒性，隨著時間延長可趨于正常。 第四部分，聚離子基因復(fù)合物的促內(nèi)涵體逃逸及腦轉(zhuǎn)運特性考察。 通過細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)定位示蹤、跨細(xì)胞單層膜培養(yǎng)實驗評價基因遞藥系統(tǒng)的雙級腦靶向特性。將Cy3標(biāo)記的pDNA包載于陽離子聚合物中，與bEnd.3細(xì)胞共孵育，結(jié)果顯示，RVG29/Tet1-polyplex能被bEnd.3細(xì)胞特異性攝取。流式細(xì)胞儀定量檢測不同配體修飾的polyplex，結(jié)果顯示，經(jīng)RVG29修飾后細(xì)胞攝取率提高了19.3%。Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)定位示蹤實驗表明，polyplex被攝取進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，定位于細(xì)胞核周圍，隨孵育時間的增加，polyplex能夠成功從內(nèi)涵體中逃逸出來，進(jìn)而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)染。將pGFP和pGL3質(zhì)粒分別包載于陽離子聚合物中，分別用于定性、定量分析。轉(zhuǎn)染定量結(jié)果顯示，Tet1-polyplex組轉(zhuǎn)染效率是未修飾組的3.3倍，雙配體修飾組在細(xì)胞中表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，是未修飾組轉(zhuǎn)染效率的4.6倍。將bEnd.3和Neuro-2a共培養(yǎng)于細(xì)胞小室Transwell中，模擬BBB屏障，跨單層膜轉(zhuǎn)運實驗表明，Tet1/RVG29-polyplex相對于修飾單配體RVG29或者Tet-1能跨過轉(zhuǎn)運透過bEnd.3細(xì)胞單層膜，，靶向于Neuro-2a細(xì)胞，增加其攝取， Tet1/RVG29-polyplex的透膜率約是未修飾組的2倍。 采用小動物活體成像技術(shù)，評價所構(gòu)建載體系統(tǒng)的體內(nèi)分布，將熒光染料DiR包裹于不同配體修飾的PEG-P[Asp (TEP)]-chole，尾靜脈注射后，于一定時間點動物活體成像儀觀察體內(nèi)熒光分布。結(jié)果表明，雙配體修飾的復(fù)合物相對于未修飾及分別修飾單配體的聚陽離子復(fù)合物具有更多的腦內(nèi)分布，說明其實現(xiàn)了雙級靶向性，增加藥物的腦部轉(zhuǎn)運。 第五部分，聚離子基因復(fù)合物沉默BACE1基因。 通過將干擾RNA構(gòu)建于質(zhì)粒，將具有干擾作用的質(zhì)粒包載于雙配體Tet1和RVG29修飾的陽離子聚合物載體中，能有效下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞Neuro-2a中的BACE1蛋白水平。 雙轉(zhuǎn)基因APP/PS1AD小鼠，尾靜脈注射polyplex后，Morris水迷宮評價小鼠的空間記憶能力，結(jié)果表明，polyplex經(jīng)Tet1和RVG29多肽修飾后，小鼠的空間記憶能力顯著提高，說明polyplex-Tet1/RVG29是一種更為有效的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)。 本課題合成了一種新型陽離子聚合物，將siRNA重組質(zhì)粒復(fù)合其中，并進(jìn)行了雙配體的修飾，構(gòu)建了一種具有腦部基因傳遞作用的聚陽離子復(fù)合物，實驗結(jié)果顯示，該載體系統(tǒng)具有良好的腦靶向性，且毒性較低，是一種有潛力的非病毒基因載體。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2436600