【摘要】：目的:研究澤瀉醇B 23-乙酸酯(alisol B 23-acetate,AB23A)的肝保護(hù)作用及其分子藥理學(xué)機(jī)制。方法:(1)澤瀉醇B 23-乙酸酯通過激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)促進(jìn)小鼠部分肝切除后的肝再生作用。灌胃給予小鼠AB23A(12,5,25和50mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第4、5、6、7天,行70%肝部分切除術(shù)或假手術(shù)。以肝臟比重、肝細(xì)胞增殖比率及有絲分裂指數(shù)評價(jià)AB23A促肝再生作用;測定細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin B1及其上游叉頭轉(zhuǎn)錄因子M1b(forkhead box M1b,FoxM1b)的基因和蛋白表達(dá),揭示AB23A促肝細(xì)胞增殖作用機(jī)制;以血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及肝內(nèi)膽汁酸水平評價(jià)AB23A肝保護(hù)作用;測定膽汁酸合成限速酶Cyp7a1和膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體Bsep表達(dá)變化,揭示AB23A降低肝內(nèi)膽汁酸水平的作用機(jī)制;采用FXR拮抗劑木苦甾酮(guggulsterone,GS)阻斷FXR信號通路,評價(jià)AB23A的體內(nèi)促肝再生及肝保護(hù)作用是否與激活FXR有關(guān);體外實(shí)驗(yàn)采用小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng),測定AB23A對FXR靶基因的誘導(dǎo)作用,并采用基因沉默實(shí)驗(yàn)測定FXR基因沉默對AB23A誘導(dǎo)FXR靶基因作用的影響;采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)評價(jià)AB23A對FXR的激活作用,以分子對接實(shí)驗(yàn)?zāi)MAB23A與FXR的結(jié)合作用。(2)澤瀉醇B 23-乙酸酯通過調(diào)控FXR介導(dǎo)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和合成酶對ANIT所致小鼠肝損傷及膽汁淤積的保護(hù)作用。灌胃給予小鼠AB23A(10,20和40 mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第5、6天給藥4小時(shí)后,灌胃給予ANIT(75 mg/kg)。以血清alt、ast、堿性磷酸酶(alp),γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-gtp),總膽紅素,總膽汁酸、肝內(nèi)總膽汁酸、膽汁中總膽汁酸水平及肝組織病理學(xué)評價(jià)ab23a對anit所致肝損傷及膽汁淤積的保護(hù)作用;測定膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體ntcp、oatp1b2及外排轉(zhuǎn)運(yùn)體bsep、mrp2、mdr2、mrp3、mrp4表達(dá),揭示ab23a對肝內(nèi)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制;測定膽汁酸合成酶cyp7a1、cyp8b1、cyp27a1及膽汁酸結(jié)合酶bal、baat表達(dá),揭示ab23a對膽汁酸合成及結(jié)合的作用機(jī)制;測定膽汁酸代謝酶cyp3a11、cyp2b10、sult2a1及ugt1a1表達(dá),揭示ab23a對膽汁酸代謝的作用機(jī)制;采用fxr拮抗劑gs阻斷fxr信號通路,評價(jià)ab23a降低肝內(nèi)膽汁酸及肝保護(hù)作用是否與激活fxr有關(guān);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)體外評價(jià)ab23a對fxr的激活作用。(3)澤瀉醇b23-乙酸酯通過激活fxr和stat3對四氯化碳所致小鼠肝毒性的保護(hù)作用。以fxr激動(dòng)劑cdca為陽性對照藥,灌胃給予小鼠ab23a(10,20和40mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第5、6天給藥4小時(shí)后,腹腔注射給予ccl4(750μl/kg)。以血清alt、ast、總膽汁酸、肝組織病理學(xué)及tunel細(xì)胞凋亡分析,評價(jià)ab23a對ccl4所致小鼠肝毒性的保護(hù)作用;以brdu染色陽性肝細(xì)胞數(shù)及有絲分裂指數(shù)評價(jià)ab23a對肝細(xì)胞增殖的影響;測定foxm1b、cyclind1及cyclinb1表達(dá),揭示ab23a促肝細(xì)胞增殖的作用機(jī)制;測定膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ntcp、bsep、mrp2及膽汁酸合成酶cyp7a1、cyp8b1表達(dá),揭示ab23a降低肝內(nèi)膽汁酸水平的作用機(jī)制;測定p-stat3及stat3靶基因bcl-xl、socs3表達(dá),揭示ab23a減少凋亡肝細(xì)胞的作用機(jī)制。(4)澤瀉醇b23-乙酸酯作用于fxr介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶對雌激素誘導(dǎo)小鼠膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用。以fxr激動(dòng)劑cdca為陽性對照藥,灌胃給予小鼠ab23a(7.5,15和30mg/kg)每日1次,連續(xù)7天。在第3天給藥4小時(shí)后,皮下注射給予10mg/kg的17α-炔雌醇(ee),每日1次,至第7天。以血清alp、總膽汁酸、膽汁流、膽汁中膽汁酸水平及肝組織病理學(xué)評價(jià)ab23a對ee誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用;測定肝內(nèi)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體bsep、mrp2及攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體ntcp表達(dá),揭示ab23a對膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制;測定膽汁酸合成酶cyp7a1、cyp8b1及上游轉(zhuǎn)錄因子shp、fgf15表達(dá),揭示ab23a對膽汁酸合成的作用機(jī)制;測定膽汁酸代謝酶cyp3a11、cyp2b10、sult2a1及ugt1a1表達(dá),揭示ab23a對膽汁酸代謝的作用機(jī)制;采用fxr拮抗劑gs阻斷fxr信號通路,評價(jià)ab23a肝保護(hù)作用是否與激活fxr有關(guān)。結(jié)果:(1)在小鼠部分肝切除實(shí)驗(yàn)中,ab23a通過上調(diào)肝細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白foxm1b,cyclind1和cyclinb1表達(dá),劑量依賴性地促進(jìn)了小鼠肝細(xì)胞增殖;ab23a通過抑制膽汁酸合成限速酶cyp7a1,誘導(dǎo)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體bsep表達(dá),降低了肝內(nèi)膽汁酸水平、發(fā)揮出肝保護(hù)作用;ab23a對上述基因表達(dá)的影響、促肝再生及肝保護(hù)作用被fxr拮抗劑gs所阻斷;體外實(shí)驗(yàn)表明ab23a對fxr靶基因的調(diào)控作用被fxr基因沉默所逆轉(zhuǎn);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和分子對接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ab23a對fxr的激活作用。(2)在抗anit所致小鼠肝損傷及膽汁淤積實(shí)驗(yàn)中,ab23a通過下調(diào)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體ntcp,上調(diào)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體bsep、mrp2及mdr2表達(dá),減少了肝臟對膽汁酸的攝取,增加了肝臟對膽汁酸的外排;通過抑制膽汁酸合成酶cyp7a1和cyp8b1的表達(dá),降低了肝內(nèi)膽汁酸的合成,通過增加膽汁酸結(jié)合酶bal和baat的表達(dá),增加了肝內(nèi)膽汁酸的結(jié)合;通過誘導(dǎo)ii相代謝酶sult2a1的表達(dá),增加了肝內(nèi)膽汁酸的代謝。進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)ab23a對anit所致肝損傷和肝內(nèi)膽汁淤積的肝保護(hù)作用是由于fxr介導(dǎo)的上述基因表達(dá)的調(diào)控。(3)在抗ccl4所致肝毒性實(shí)驗(yàn)中,ab23a通過調(diào)節(jié)參與肝細(xì)胞dna復(fù)制及有絲分裂的重要基因foxm1b、cyclind1及cyclinb1的表達(dá),促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖;通過下調(diào)肝內(nèi)膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體ntcp和合成酶cyp7a1、cyp8b1的表達(dá),上調(diào)膽汁酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)體bsep、mrp2的表達(dá),降低了肝內(nèi)膽汁酸水平;此兩方面的作用與ab23a激活核受體fxr直接相關(guān);通過誘導(dǎo)p-stat3及stat3靶基因bcl-xl、socs3表達(dá),減少了肝細(xì)胞的凋亡。(4)在雌激素誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷實(shí)驗(yàn)中,ab23a通過上調(diào)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體bsep和mrp2,下調(diào)肝臟膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體ntcp的表達(dá),增加了肝臟對膽汁酸的外排,減少了肝臟對膽汁酸的攝取;通過抑制膽汁酸合成酶cyp7a1和cyp8b1的表達(dá),降低了肝內(nèi)膽汁酸的合成;通過誘導(dǎo)ii相代謝酶sult2a1的表達(dá),增加了肝內(nèi)膽汁酸的代謝。并進(jìn)一步證實(shí)了ab23a對ee所致膽汁淤積性肝損傷的肝保護(hù)作用是由于fxr介導(dǎo)的上述基因表達(dá)的調(diào)控。結(jié)論:ab23a通過激活fxr,促進(jìn)了小鼠部分肝切除后的肝再生;通過調(diào)控FXR介導(dǎo)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和合成酶對ANIT所致肝損傷及膽汁淤積具有保護(hù)作用;通過激活FXR和STAT3對四氯化碳所致肝小鼠肝毒性發(fā)揮保護(hù)作用;通過作用于FXR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶對雌激素誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷起到保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R96

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本文編號：2425674