【摘要】：血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是由28個氨基酸組成的直鏈陽離子神經(jīng)肽,在體內(nèi)廣泛分布并發(fā)揮多種重要的生物作用。VIP作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的保護作用,這種作用與VIP強大的抗炎、抗氧化及抗凋亡功能有關(guān)。已經(jīng)證實,VIP與多種神經(jīng)發(fā)育性和神經(jīng)炎癥疾病如唐氏綜合癥、胎兒酒精綜合癥、多發(fā)性硬化、帕金森病和阿爾茲海默病等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),肝素與VIP的相互作用可能在VIP的神經(jīng)保護機制中扮演重要角色,VIP可促進腦肥大細胞分泌多種神經(jīng)保護性物質(zhì)如神經(jīng)生長因子和肝素等,肥大細胞分泌的肝素可以使VIP與其受體失偶聯(lián),增加細胞內(nèi)的c-AMP濃度而介導(dǎo)VIP的細胞內(nèi)作用。本研究以VIP體外抗菌活性為指標,初步探索了肝素寡糖與VIP的相互作用,并構(gòu)建了表達VIP的大腸桿菌菌株,表達純化出純度超過95%的VIP及15N-VIP,為研究肝素寡糖對VIP結(jié)構(gòu)的影響奠定了基礎(chǔ)。 1內(nèi)含肽介導(dǎo)的VIP及15N-VIP表達純化 采用內(nèi)含肽介導(dǎo)的幾丁質(zhì)標簽親和純化(IMPACT)系統(tǒng)來制備VIP及’5N標記的VIP (15N-VIP)。其策略是將目的蛋白和內(nèi)含肽(intein)及幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)融合表達,由CBD介導(dǎo)使融合蛋白和幾丁質(zhì)樹脂親和結(jié)合,由具有可誘導(dǎo)自剪切活性的蛋白剪接元件—intein介導(dǎo),使目的蛋白與親和標簽分離。本實驗選用的表達載體為pTWINl,將插入片段連接在載體的SapⅠ和PstⅠ酶切位點間,構(gòu)建表達融合蛋白CBD-Ssp Dnab Intein-VIP的重組載體pTWIN1-VIP,通過溫度和緩沖液pH的改變誘導(dǎo)intein的自切割活性。 首先根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性設(shè)計編碼VIP28個氨基酸的cDNA序列,并在其3’和5’端分別加入Sap Ⅰ酶切位點和終止密碼子、Pst I酶切位點。將所設(shè)計的序列插入PUC57載體,人工合成重組載體PUC57-VIP。以重組載體PUC57-VIP為模板進行PCR擴增目的基因,然后用限制性內(nèi)切酶SapⅠ和PstⅠ切割PCR產(chǎn)物作為待插入片段。以相同的限制性內(nèi)切酶酶切表達載體pTWIN1,再用T4DNA連接酶將插入片段和線性載體連接,測序結(jié)果表明成功構(gòu)建重組載體pTWIN1-VIP。將重組載體轉(zhuǎn)化入表達菌ER2566,成功構(gòu)建表達融合蛋白CBD-Ssp Dnab Intein-VIP的工程菌。 與未誘導(dǎo)組相比,工程菌表達大小約30kD的蛋白,進一步說明重組載體構(gòu)建正確。 IPTG濃度的影響：首先考察了IPTG濃度對融合蛋白表達量的影響,發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對表達量的影響很小,0.3mM時表達量稍有提高。 誘導(dǎo)溫度的影響：誘導(dǎo)溫度對融合蛋白的表達量及結(jié)構(gòu)形成至關(guān)重要。本實驗考察了15℃、25℃和30℃誘導(dǎo)時融合蛋白的表達量及被誘導(dǎo)切割的效率。電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)溫度越低,上清可溶性表達的融合蛋白比例越大,且15℃和25℃誘導(dǎo)時融合蛋白沒有發(fā)生胞內(nèi)切割；30℃誘導(dǎo)時,上清可溶性表達的融合蛋白比例降低,且約有77%被胞內(nèi)切割。誘導(dǎo)溫度為15℃和25℃時融合蛋白不能被切割,而誘導(dǎo)溫度為30℃時,融合蛋白的在柱切割效率約為68%。故最終確定的誘導(dǎo)表達條件為0.3mM IPTG、30℃誘導(dǎo)3h。 切割緩沖液pH值的影響：考察了pH為5.0至7.0的切割緩沖液對融合蛋白切割效率的影響,結(jié)果表明,pH6.0時切割效率最高。 使用微型透析柱對目的肽洗脫液進行脫鹽,再用MWCO分別為10kD和2kD的超濾管超濾脫鹽后的樣品,進一步除去大小約為30kD和小于2kD的雜質(zhì)。最終可從1L發(fā)酵液中獲得270.8μg純度大于95%的VIP, LC-IT-TOF質(zhì)譜檢測的VIP分子量(3323.82Da)與理論值一致。 用構(gòu)建的表達CBD-Ssp Dnab Intein-VIP的大腸桿菌菌株在15N-M9培養(yǎng)基中表達’5N標記的融合蛋白。誘導(dǎo)溫度為15℃、25℃和30℃時發(fā)現(xiàn),融合蛋白都發(fā)生了不同程度的胞內(nèi)切割,且30℃時融合蛋白的比例相對最高,在柱切割效率約為56%。對目的肽洗脫液脫鹽及超濾后,可從1L發(fā)酵液中獲得100.5μg純度大于95%的15N-VIP。LC-IT-TOF質(zhì)譜檢測純化的15N-VIP分子量(3366.76Da)與理論值一致。 2肝素寡糖的制備及分離純化 使用肝素酶Ⅰ在優(yōu)化的條件下對肝素鈉進行酶解。100mg肝素鈉溶解后加入40μL肝素酶Ⅰ溶液,35℃水浴反應(yīng)6h。使用Bio gel P10凝膠層析柱,以0.2M NH4HCO3溶液為流動相,以0.16mL/min的流速對各肝素寡糖組分進行分離。使用PD MidiTrap G-10柱對分離的各肝素寡糖進行脫鹽。負離子電子轟擊質(zhì)譜(ESI-MS)結(jié)果表明,所分離純化的各肝素寡糖分子量與理論值相符。 3肝素寡糖抑制VIP抗菌活性的研究 徑向擴散法(radical diffusion assay, RDA)是檢測分子抗菌活性的靈敏有效的方法。本實驗選擇C. albicans作為受試菌,用RDA法檢測肝素寡糖對VIP抗菌活性的影響。本實驗考察了等摩爾的各肝素寡糖對C. albicans的作用,與VIP(500μg/mL)等摩爾的各肝素寡糖對其抗菌活性的影響及不同摩爾數(shù)的肝素八糖對VIP (500μg/mL)抗菌活性的影響。實驗結(jié)果表明,RDA法可靈敏地檢測VIP的抗菌活性及抗菌活性的變化。對抑菌圈直徑進行統(tǒng)計分析后表明：(1)各肝素寡糖對C. albicans無抗菌作用；(2)除dp2和dp4外,其他各肝素寡糖可明顯抑制VIP的抗菌活性,且dp8的作用最明顯：(3)隨著dp8與VIP摩爾比的降低,dp8對VIP抗菌活性的抑制作用減弱,在dp8與VIP的摩爾比降到約1：6時達到平臺期,無可見的抑制作用。 綜上所述,本論文確證了肝素寡糖可以與VIP相互作用,且作用區(qū)域為VIP的抗菌活性結(jié)構(gòu)域,肝素八糖為最短的有效結(jié)合片段。成功構(gòu)建了VIP在大腸桿菌中的重組表達體系。肝素與VIP的相互作用在VIP的神經(jīng)保護機制中扮演重要角色。本課題對深入研究肝素寡糖與VIP在分子水平上的相互作用,進而探索VIP發(fā)揮神經(jīng)保護作用的內(nèi)在機制提供了良好的前期基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

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本文編號：2401295