【摘要】：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體y (PPARy)屬于核受體超家族成員,是一種配體激活型轉(zhuǎn)錄因子,在糖脂代謝、炎癥和癌癥中起著關(guān)鍵作用。在人體脂肪組織細(xì)胞,巨噬細(xì)胞及肝、肺等脂肪貯存細(xì)胞中均有不同程度的PPARy表達(dá)活性。當(dāng)有配體存在時(shí),被激活的PPARy可以發(fā)揮促進(jìn)脂肪細(xì)胞的生成和分化,緩解胰島素抵抗,負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及延緩組織器官纖維化等作用,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展都有著密切的關(guān)系。隨著高通量藥物篩選技術(shù)的不斷發(fā)展,基于靶點(diǎn)或者靶信號(hào)的藥物篩選逐步成為藥物研發(fā)的最有效方式之一。因此,構(gòu)建一種基于PPARy信號(hào)通路的高通量藥物篩選模型,并應(yīng)用于PPARy激動(dòng)劑的篩選,將會(huì)為心血管相關(guān)疾病的治療提供更多的候選藥物,開(kāi)拓疾病治療的新途徑。本課題構(gòu)建了一種基于PPARy信號(hào)通路的高通量藥物篩選模型,并將其應(yīng)用于天然單體化合物的篩選,同時(shí)對(duì)得到的先導(dǎo)化合物做了初步探究。我們通過(guò)擇優(yōu)選擇PPARy組成型活化細(xì)胞,并對(duì)PPARy響應(yīng)元件PPRE比例進(jìn)行多次調(diào)整,最終得到藥物篩選模型細(xì)胞CLPPD。該模型以Chang Liver為宿主細(xì)胞,以熒光素酶為報(bào)告基因,含有23個(gè)PPRE重復(fù)序列的響應(yīng)元件及完整PPARy表達(dá)元件。通過(guò)DNA測(cè)序、Western-Blot實(shí)驗(yàn)及傳代實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞模型成功插入目的元件并穩(wěn)定性良好,能夠應(yīng)用于PPARy激動(dòng)劑的篩選。隨后我們篩選了2500余種天然單體化合物,復(fù)篩得到了5種有信號(hào)激活作用的先導(dǎo)化合物,其中以15#化合物作用最佳。通過(guò)MTT方法及熒光活性檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)15#化合物細(xì)胞毒性小,且相比于對(duì)照在15μM處理濃度下有2倍的PPARy激活作用。Western-Blot實(shí)驗(yàn)及半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),15#化合物可提高PPARy在CLPPD細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中的表達(dá)活性。綜上所述,我們成功構(gòu)建了一種PPARy激動(dòng)劑的高通量篩選模型,并將其應(yīng)用于2500余種天然產(chǎn)物的篩選,最終得到5種先導(dǎo)化合物,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)15#化合物能顯著激活PPARy,并促進(jìn)PPARy的表達(dá),為進(jìn)一步篩選得到PPARy激動(dòng)劑,尋找心血管疾病靶向藥物提供了一定的技術(shù)和理論依據(jù)。
[Abstract]:Peroxisome proliferator activated receptor (y (PPARy), a member of nuclear receptor superfamily, is a ligand activated transcription factor, which plays a key role in glycolipid metabolism, inflammation and cancer. In human adipose tissue cells, macrophages, liver, lung and other fat storage cells have different degrees of PPARy expression activity. In the presence of ligands, activated PPARy can promote adipocyte formation and differentiation, alleviate insulin resistance, negatively regulate inflammatory response, regulate tumorigenesis and progression, and delay fibrosis of tissues and organs. It is closely related to the occurrence and development of many diseases. With the development of high throughput drug screening technology, drug screening based on target or target signal has gradually become one of the most effective methods of drug development. Therefore, the establishment of a high-throughput drug screening model based on PPARy signaling pathway and its application to the screening of PPARy agonists will provide more candidate drugs for the treatment of cardiovascular diseases and open up new approaches to the treatment of cardiovascular diseases. In this paper, a high throughput drug screening model based on PPARy signaling pathway was constructed and applied to the screening of natural monomers. We selected the PPARy constitutive activated cells selectively, and adjusted the PPRE ratio of PPARy response elements many times. Finally, we obtained the drug screening model cells CLPPD.. The model uses Chang Liver as host cell and luciferase as reporter gene. It contains 23 response elements of PPRE repeat sequence and complete PPARy expression element. The DNA sequencing, Western-Blot and passage experiments confirmed that the cell model was successfully inserted into the target element and stable, and could be applied to the screening of PPARy agonists. Then we screened more than 2500 natural monomers and obtained five leading compounds with signal-activated activity, of which 15# was the best. By MTT method and fluorescence assay, we found that the cytotoxicity of 15# compound was less than that of the control, and the activity of PPARy was twice as much as that of the control at the concentration of 15 渭 M. Western-Blot and semi-quantitative RT-PCR experiments further confirmed the cytotoxicity of 15# compound. Compound 15# could increase the activity of PPARy expression in CLPPD cells and THP-1 cells. To sum up, we successfully constructed a high-throughput screening model for PPARy agonists, and applied it to the screening of more than 2500 natural products. Finally, five leading compounds were obtained. Further studies showed that 15# compounds could significantly activate PPARy,. It can also promote the expression of PPARy and provide some technical and theoretical basis for the further screening of PPARy agonists and the search for targeted drugs for cardiovascular diseases.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2377608