【摘要】：丙烯酰胺(acrylamide, ACR)是國(guó)際上確認(rèn)的一種神經(jīng)毒物,其中毒患者主要是生產(chǎn)和使用單體的作業(yè)者,中毒表現(xiàn)尤其易出現(xiàn)在通風(fēng)不良和缺乏個(gè)人防護(hù)的工作條件下。在ACR(如丙烯酰胺生產(chǎn)、聚丙烯酰胺合成、污水處理、石油開(kāi)采、建筑工程灌漿等)的職業(yè)接觸人群中,職業(yè)性損害主要表現(xiàn)為皮膚損害以及神經(jīng)系統(tǒng)損害,神經(jīng)系統(tǒng)損害又包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(PeriPheralnervousSystem, PNS)損害。90%的ACR單體用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺(Polyaerylamide, PACR),近年來(lái),石油工業(yè)發(fā)展迅速,PACR的需求量隨之不斷增加,因而ACR需求量隨之不斷增加,危害越來(lái)越大,對(duì)ACR的研究相應(yīng)越來(lái)越多。但有關(guān)ACR神經(jīng)毒作用的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全闡明。有學(xué)者認(rèn)為ACR中毒是由軸漿運(yùn)輸損傷引起的。細(xì)胞骨架在軸漿運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用,ACR通過(guò)作用于軸突細(xì)胞骨架蛋白的不同成分而影響軸漿運(yùn)輸,從而導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸突功能改變,導(dǎo)致神經(jīng)損傷。而細(xì)胞骨架蛋白聚集或降解可能是由鈣離子依賴(lài)性蛋白酶(Calpain)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白分解引起的。Calpain通過(guò)影響骨架蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為,CNS損傷后細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平升高,可增強(qiáng)Calpain活性,選擇性降解髓磷脂蛋白及多種細(xì)胞骨架蛋白。有學(xué)者應(yīng)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后Calpain的表達(dá)增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中選擇神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)進(jìn)行離體研究,NSCs具有多向分化潛能,在研究神經(jīng)系統(tǒng)毒性時(shí)具有代表性；能進(jìn)行自我增殖,可提供實(shí)驗(yàn)所需的大量細(xì)胞。自出生24h內(nèi)的Wistar新生大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglion, DRG)獲取原代細(xì)胞并進(jìn)行鑒定,獲取穩(wěn)定的細(xì)胞株。然后進(jìn)行細(xì)胞ACR染毒,用噻唑蘭比色法(MTT)法測(cè)定吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率以建立ACR對(duì)NSCs損傷的染毒模型,在此模型的基礎(chǔ)上用鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170進(jìn)行干預(yù),建立干預(yù)模型。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及Calpain活性進(jìn)一步確定鈣蛋白酶抑制劑對(duì)ACR誘發(fā)NSCs毒性的干預(yù)作用。 目的 1.本實(shí)驗(yàn)建立ACR對(duì)NSCs的損傷模型,通過(guò)Calpain抑制劑MDL-28170抑制Calpain的活性達(dá)到抑制ACR引起的NSCs損傷的目的。 2.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及Calpain活性,進(jìn)一步確定ACR對(duì)NSCs的損傷及鈣蛋白酶抑制劑對(duì)這種損傷的干預(yù)作用,為后續(xù)研究神經(jīng)絲蛋白(Neuro filament, NF)變化機(jī)制、預(yù)防ACR暴露工人的NSCs損傷提供參考。 方法 1.無(wú)菌條件下摘取出生24h內(nèi)新生大鼠的DRG,胰蛋白酶消化后進(jìn)行接種,通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)的方法檢測(cè)巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase, NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP)三個(gè)指標(biāo),以確認(rèn)所培養(yǎng)細(xì)胞為NSCs。進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng),獲取穩(wěn)定的細(xì)胞株。 2.對(duì)建立的細(xì)胞株進(jìn)行ACR的染毒和MDL-28170干預(yù)劑量篩選,用MTT法測(cè)定吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率來(lái)確定染毒劑量和染毒持續(xù)時(shí)問(wèn),建立細(xì)胞染毒及干預(yù)模型。 3.使用Fura-2/AM探針和calpain substrate11分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及Calpain活性。 結(jié)果 1.原代細(xì)胞的獲取及鑒定 細(xì)胞免疫化學(xué)染色,NSCs的標(biāo)志性蛋白Nestin染色呈陽(yáng)性,而且相同來(lái)源的細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成NSE陽(yáng)性的神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性的膠質(zhì)細(xì)胞。 2.染毒及干預(yù)模型的建立 (1)ACR的染毒濃度為0、1400、2800、4200、5600μmol/L,染毒24小時(shí)后,自2800μmol/LACR染毒組開(kāi)始與對(duì)照組細(xì)胞存活率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；染毒48小時(shí)后,自1400μmol/LACR染毒組開(kāi)始與對(duì)照組細(xì)胞存活率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。根據(jù)上述結(jié)果ACR24小時(shí)染毒劑量調(diào)整為0、2240、2520.2800,3080μmol/L后,染毒后細(xì)胞存活率自2240μmol/LACR染毒組開(kāi)始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);48小時(shí)ACR染毒劑量調(diào)整為0、700、840、980、1120.1400μmol/L,染毒后細(xì)胞存活率自700μmol/LACR染毒組開(kāi)始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。24小時(shí)染毒劑量為0、1050、1400、1750、2100μmol/L時(shí),染毒后細(xì)胞存活率自2100μmol/LACR染毒組開(kāi)始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；48小時(shí)染毒劑量調(diào)整為0、140、350、560.700μmol/L,染毒后細(xì)胞存活率自700μmol/LACR染毒組開(kāi)始與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)o2100μmol/L染毒24小時(shí)與700μmol/L染毒48小時(shí)可定為實(shí)驗(yàn)染毒劑量和染毒持續(xù)時(shí)間。 (2)ACR染毒的濃度和染毒持續(xù)時(shí)間分別為2100μmol/L染毒24小時(shí)與700μmol/L染毒48小時(shí),同時(shí)鈣蛋白酶抑制劑以65、130、195、260μmol/L的濃度進(jìn)行干預(yù)。 24小時(shí)干預(yù)結(jié)果：所有染毒、干預(yù)組的細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。65、130μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率高于染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);195、260μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率低于染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 48小時(shí)干預(yù)結(jié)果：染毒、干預(yù)組的細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。65、130μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率高于染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05)；195μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率與染毒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；260μmol/L干預(yù)組細(xì)胞存活率低于染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組相比：染毒組的鈣離子濃度高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；干預(yù)組鈣離子濃度平均值高于對(duì)照組,但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與染毒組相比：干預(yù)組鈣離子濃度低于染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4. Calpain活性測(cè)定結(jié)果 與對(duì)照組相比：染毒組的Calpain活性高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；干預(yù)組Calpain活性高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與染毒組相比：干預(yù)組Calpain活性低于染毒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.成功培養(yǎng)并鑒定了NSCs,建立了NSCs的ACR中毒模型及鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170對(duì)ACR誘發(fā)中毒的干預(yù)模型。 2.ACR可造成NSCs的損傷,引起細(xì)胞存活率下降,細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高,Calpain活性增強(qiáng)；MDL-28170對(duì)這種損傷有一定的抑制作用,可有效提高細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平及Calpain活性。 3.鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170對(duì)ACR導(dǎo)致的的NSCs毒性有干預(yù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R97

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2323108