【摘要】：目的:探討miR146a參與多柔比星心肌細胞毒性作用的可能機制。方法:用多柔比星處理大鼠心肌細胞,用CCK-8方法檢測細胞活力,用熒光定量PCR檢測miR146a的變化,用Western blot檢測切割的Caspase 3的蛋白變化。使用常間回文重復序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的方法,設計針對miR146a的向導RNA,敲除miR146a的表達。用CCK-8方法和Western blot分別檢測敲除細胞的活力和Caspase 3蛋白變化。用軟件預測miR146a的靶基因,利用熒光素酶系統(tǒng)進行驗證。用Western blot檢測多柔比星處理后靶基因的變化,以及用Western blot檢測敲除miR146a對靶基因變化的影響。結果:多柔比星處理導致大鼠心肌細胞活力降低,切割的Caspase 3水平升高,同時發(fā)現(xiàn)miR146a表達升高(3.6倍)。使用CRISPR可有效敲除miR146a的表達,敲除效果顯著高于microRNA decoy的效果(88.6%vs 57.6%)。敲除miR146a的細胞用多柔比星處理,miR146a增加不明顯(1.08倍),并且敲除miR146a抑制了多柔比星導致的細胞活力降低和Caspase 3升高。經(jīng)生物信息學及熒光素酶檢測證實在大鼠心肌細胞內(nèi)Smad family member 4(Smad4)是miR146a的靶基因,用多柔比星處理心肌細胞后,Smad4的表達降低。而敲除miR146a后,Smad4的表達升高,用多柔比星處理敲除miR146a的細胞,Smad4的表達變化不明顯。結論:大鼠心肌細胞中,miR146a通過調(diào)節(jié)Smad4的表達參與了多柔比星對細胞的毒性作用。
[Abstract]:Objective: to investigate the possible mechanism of miR146a involved in doxorubicin cardiotoxicity. Methods: rat cardiomyocytes were treated with doxorubicin, cell viability was detected by CCK-8, miR146a was detected by fluorescence quantitative PCR, and the protein of Caspase 3 was detected by Western blot. Using the method of frequent palindrome repeat sequence cluster (clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR), the RNA, wizard for miR146a is designed to knock out the expression of miR146a. The activity of knockout cells and the changes of Caspase 3 protein were detected by CCK-8 and Western blot, respectively. The target gene of miR146a was predicted by software and verified by luciferase system. Western blot was used to detect the change of target gene after doxorubicin treatment, and Western blot was used to detect the effect of knockout miR146a on target gene change. Results: doxorubicin treatment decreased the activity of cardiac myocytes, increased the level of Caspase _ 3, and increased the expression of miR146a (3.6-fold). CRISPR could effectively knock out the expression of miR146a, and the knockout effect was significantly higher than that of microRNA decoy (88.6%vs 57.6%). MiR146a knockout cells treated with doxorubicin did not increase significantly (1.08 times), and knockout miR146a inhibited the decrease of cell viability and the increase of Caspase 3 induced by doxorubicin. Bioinformatics and luciferase detection confirmed that Smad family member _ 4 (Smad4) was the target gene of miR146a in rat cardiomyocytes, and the expression of Smad4 was decreased after treated with doxorubicin. However, the expression of Smad4 was increased after knockout of miR146a, but the expression of Smad4 in miR146a knockout cells treated with doxorubicin had no obvious change. Conclusion: miR146a is involved in the cytotoxicity of doxorubicin by regulating the expression of Smad4 in rat cardiomyocytes.
【作者單位】： 貴州省遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院;
【基金】：貴州省2013年度遵義醫(yī)學院聯(lián)合基金資助項目(黔科合J字CK-898)
【分類號】：R96

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本文編號：2250209