【摘要】：研究背景 天然金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphy lococcal protein A, SPA,蛋白A)是一種存在于大多數(shù)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的單肽鏈蛋白質(zhì)[1]。SPA的氨基末端有5個(gè)高度同源的Fc結(jié)合區(qū),可與人類及其他哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白IgG的Fcγ段結(jié)合[2],SPA的羧基末端則可交聯(lián)各種支架結(jié)構(gòu),如與瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠等共價(jià)偶合,以此來(lái)制備rSPA親和填料[3]。SPA與免疫球蛋白的結(jié)合是可逆的,在生理pH下兩者可緊密結(jié)合,當(dāng)pH值降低至2.3-2.5時(shí),SPA可被解離洗脫,而當(dāng)恢復(fù)到生理pH后,SPA又可恢復(fù)結(jié)合免疫球蛋白的能力,這種特性使SPA免疫吸附劑可以重復(fù)使用。蛋白A免疫吸附劑是免疫吸附(immunoadsorption, IA)治療中應(yīng)用最廣泛的吸附劑,它以SPA為配基,與固相載體結(jié)合制成吸附柱,通過(guò)選擇性地清除血中致病抗體,從而達(dá)到凈化血液,緩解病情的目的。目前,國(guó)外利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組rSPA (recombinant staphy lococcal protein A, rSPA),實(shí)現(xiàn)了SPA的工業(yè)化生產(chǎn),Immunosorba和Prosorba是最常用的兩種蛋白A吸附柱,二者均獲得了美國(guó)食品和藥物管理委員會(huì)(FDA)的認(rèn)證,用于治療特發(fā)性血小板減少性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及帶有抑制因子的血友病等[4-6]。在國(guó)內(nèi),由于原材料蛋白A的純化技術(shù)和蛋白A免疫吸附劑的合成工藝落后,國(guó)產(chǎn)蛋白A免疫吸附劑并未得到工業(yè)化生產(chǎn),而進(jìn)口蛋白A免疫吸附劑因?yàn)閮r(jià)格昂貴而極大地限制了臨床應(yīng)用。目前,國(guó)際上最常用的蛋白A免疫吸附材料,采用溴化氰和羰基咪唑作為活化劑,這些方法都具有一定的缺陷。為此,本文利用前期在實(shí)驗(yàn)室純化的重組蛋白A的基礎(chǔ)上,嘗試尋找一種適用于制備醫(yī)用蛋白A免疫吸附劑的合成路徑。本研究以瓊脂凝膠Sepharose-6FF為載體,分別采用環(huán)氧氯丙烷(ECH)和高碘酸鈉(NaIO4)作為活化劑,優(yōu)化其反應(yīng)條件后,從活化基團(tuán)密度、rSPA偶聯(lián)量和對(duì)IgG的吸附量等方面比較優(yōu)化效果,對(duì)于合成的免疫吸附劑,通過(guò)其對(duì)人血漿中不同類型抗體成分的吸附和重復(fù)使用性評(píng)價(jià)使用效果,并且通過(guò)檢測(cè)其配基rSPA的脫落量等方面來(lái)進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。我們的目的是探尋一種能生產(chǎn)出低成本、安全、高效的蛋白A吸附劑的合成方法,該研究為蛋白A免疫吸附劑的工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛的臨床運(yùn)用奠定了基礎(chǔ)。 研究方法 1.ECH活化瓊脂糖凝膠 1.1NaOH濃度對(duì)環(huán)氧基活化密度的影響 取一定體積的瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF,置于玻璃漏斗中,并用大量反滲水沖洗,并真空抽干3min,稱取7份樣品,每份5g,分別置于50mL的錐形瓶中。每瓶加入5ml ECH和5ml NaOH溶液(濃度分別為1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4mol/l)。封口后放入搖床(40℃,180rpm)[7],反應(yīng)2h后,用大量反滲水沖洗至清洗液中無(wú)環(huán)氧基殘留,真空抽干3min后,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定其環(huán)氧基的密度。 1.2ECH用量對(duì)環(huán)氧基活化密度的影響 取一定體積的瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF,洗凈并抽干如1.1,稱取5份,每份5g,分別置于50mL的錐形瓶中。加入5ml一定濃度的NaOH,再加入ECH,濃度分別為(10%、20%、30%、40%和50%(v/v)),封口后放入搖床(40℃,180rpm)反應(yīng)2h,用大量反滲水沖洗至清洗液無(wú)環(huán)氧基殘留,真空抽干3min后,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定其環(huán)氧基的密度。 1.3反應(yīng)時(shí)間對(duì)環(huán)氧基活化密度的影響 取一定體積的瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF,洗凈并真空抽干如1.1,稱取4份,每份5g,分別置于50mL的錐形瓶中。加入5ml ECH和5ml一定濃度的NaOH溶液,封口后放入搖床分別反應(yīng)1h、2h、3h和4h后,用大量反滲水沖洗至清洗液無(wú)環(huán)氧基殘留,真空抽干3mmin,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定其環(huán)氧基的密度。 1.4反應(yīng)溫度對(duì)環(huán)氧基活化密度的影響 取一定體積的瓊脂糖凝膠,沖洗并真空抽干如1.1,稱取4份,每份5g,分別置于50mL的錐形瓶中。加入5ml ECH和5ml一定濃度的NaOH溶液,封口后分別于20℃、30℃、40℃、50℃條件下反應(yīng)2h,沖凈至清洗液無(wú)環(huán)氧基殘留,真空抽干3min后,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定其環(huán)氧基的密度。 2.NaIO4活化瓊脂糖凝膠 2.1NaIO4加入量的影響 取一定體積的瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF,沖洗并真空抽干如1.1,稱取5份,每份5g,分別置于50mL的錐形瓶中。加入5m1NaIO4,濃度為(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/1),封口后放入搖床反應(yīng)(37℃,180rpm),反應(yīng)4h,再用反滲水沖洗至清洗液用碘化鉀試紙檢驗(yàn)顯示為無(wú)色,真空抽干3min,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定醛基密度。 2.2反應(yīng)溫度的影響 取一定體積的瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF,沖洗并真空抽干如1.1,稱取5份,每份5g,分別裝入50mL的錐形瓶中。加入0.1mmol/1的NaIO4溶液,封口后放入搖床分別在25℃,35℃和40℃條件下,180rpm,反應(yīng)4h后,再用反滲水沖洗至清洗液用碘化鉀試紙檢驗(yàn)顯示為無(wú)色,真空抽干3min,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定醛基密度。 2.3反應(yīng)時(shí)間的影響 取洗凈并抽干的Sepharose-6FF5份,每份5g,分別裝入50mL的錐形瓶中,加入0.1mol/1的NaIO4溶液,封口后放入搖床(37℃,180rpm),分別反應(yīng)1h、2h、3h和4h,再用反滲水沖洗,至清洗液用碘化鉀試紙檢驗(yàn)顯示為無(wú)色,真空抽干3min,留取活化的瓊脂糖凝膠并測(cè)定其醛基密度。 3. rSPA的用量對(duì)免疫吸附劑的rSPA偶聯(lián)量的影響 3.1rSPA的用量對(duì)ECH活化的Sepharose-6FF的蛋白質(zhì)A偶聯(lián)量的影響 取ECH活化所得的瓊脂糖凝膠分成6份,每份10g,連接己二胺和戊二醛之后,各加入不同量的rSPA (1、2、3、4、5和6mg/g gel),在37℃,180rpm條件下反應(yīng)24h后,抽干反應(yīng)溶液,加100ml反滲水沖洗凝膠,留取清洗液,測(cè)量體積。再反復(fù)沖洗后,抽干凝膠,用乙醇胺溶液作為封端劑,最后用5%硼氫化鈉溶液作為還原劑。用BCA試劑盒測(cè)定清洗液中的rSPA的濃度,用差量法計(jì)算rSPA的偶聯(lián)量,方法按照試劑盒說(shuō)明。 3.2rSPA的用量對(duì)NaIO4活化的Sepharose-6FF的rSPA偶聯(lián)量的影響 取NaIO4活化所得的瓊脂糖凝膠分成6份,每份10g,加入不同量的rSPA(1、2、3、4、5和6mg/g gel),在37℃,180rpm下反應(yīng)24h后,抽干反應(yīng)溶液,加100ml反滲水沖洗凝膠,留取清洗液,測(cè)量體積。再反復(fù)沖洗后,抽干凝膠,用5%硼氫化鈉溶液作為還原劑。用BCA試劑盒測(cè)定清洗液中的rSPA的濃度,用差量法計(jì)算rSPA的偶聯(lián)量,方法按照試劑盒說(shuō)明。 3.3用未活化的Sepharose-6FF作為空白對(duì)照吸附劑,處理方法如3.2 4. rSPA的用量對(duì)吸附劑的IgG吸附量的影響 (1)選取合適的玻璃層析柱(d=1cm, V=10ml),將其與配套恒流泵和核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀的色譜系統(tǒng)組聯(lián),檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。 (2)取ECH法所制備的吸附劑和NaIO4法所制備吸附劑(從3中獲得)兩種rSPA吸附劑,用大量的反滲水沖洗,并真空抽干后,準(zhǔn)確稱取2.8g(沉降體積4.2ml) rSPA免疫吸附劑裝入柱內(nèi)。 (3)用平衡液10mL、20mL洗脫液和30mL平衡液依次沖洗柱子(流速5.0ml/min),至核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀所測(cè)基線平穩(wěn)。 (4)取20ml血漿,加入柱內(nèi)(流速為2.5ml/min),血漿通過(guò)吸附柱后,收集穿流吸附柱的血漿,測(cè)量其體積。再加入平衡液40ml沖洗柱體(流速為5ml/min),至核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀所測(cè)基線平穩(wěn)后,加入洗脫液(流速為5ml/min),觀察核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀數(shù)值變化,在洗脫峰處收集洗脫液,并測(cè)量洗脫液的體積,將收集的洗脫液pH值調(diào)節(jié)至7,采用免疫比濁法測(cè)量洗脫液中IgG的含量,比較兩種吸附劑的對(duì)IgG吸附能力。 5. rSPA免疫吸附劑對(duì)血漿中各組分的吸附量的比較 (1)取ECH所制備的吸附劑(rSPA用量為6mg/g gel)、NaI04所制備吸附劑(rSPA用量為6mg/g gel)和未活化的Sepharose-6FF三種填料,沖洗并抽干后的各稱取2.8g,進(jìn)行血漿吸附實(shí)驗(yàn),處理方法同4。 (2)收集穿流吸附柱的血漿樣品,測(cè)量穿流吸附柱的血漿的體積。采用免疫比濁法測(cè)量血漿原液和穿流血漿中白蛋白、IgG、IgM、IgA、纖維蛋白原、甘油三脂、膽固醇、脂蛋白(高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)等血漿蛋白質(zhì)的濃度,用差值法計(jì)算吸附量。 6.兩種rSPA吸附劑的重復(fù)使用性檢測(cè) (1)取兩種rSPA免疫吸附劑(rSPA用量為6mg/g gel),沖洗并真空抽干后,各稱取2.8g,進(jìn)行血漿吸附實(shí)驗(yàn),處理方法同4。 (2)每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用平衡液10mL,20mL洗脫液和30mL平衡液依次沖洗柱子(流速5ml/min),使吸附劑的吸附能力再生,然后重復(fù)實(shí)驗(yàn)(方法同4),共10次,收集每次實(shí)驗(yàn)所得洗脫液,測(cè)量洗脫液的體積,并采用免疫比濁法測(cè)量洗脫液中IgG的含量,計(jì)算兩種吸附劑對(duì)IgG的吸附量,以此評(píng)估吸附劑的重復(fù)使用性。 7.蛋白A吸附劑的rSPA脫落量的檢測(cè) (1)分別取ECH所制備的吸附劑(rSPA用量為6mg/g gel)、NaIO4所制備吸附劑(rSPA用量為6mg/g gel)各75ml,裝入合適的玻璃層析柱內(nèi)。 (2) rSPA免疫吸附柱接入血管通路和恒流泵。 (3)先用3L生理鹽水沖洗填料和管路,然后用1L生理鹽水沖洗填料。然后收集這1L生理鹽水沖洗液,測(cè)定該沖洗液中的rSPA的含量。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差齊的樣本均數(shù)的比較采用one-way ANOVA,多組均數(shù)組間的比較采用LSD法,重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)用repeated measures ANOVA方差分析,所有統(tǒng)計(jì)分析由軟件SPSS17.0完成,P0.05為有顯著差異。 結(jié)果 1.ECH法活化瓊脂糖凝膠條件的優(yōu)化 1.1NaOH濃度的影響 6份瓊脂糖凝膠樣品,在不同濃度的NaOH溶液(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mol/l)條件下活化。結(jié)果顯示：瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基活化密度有顯著差異(方差齊,采用one-way ANOVA,F=278.466,P=0.00)。NaOH溶液濃度值從1增加到3.5mol/1時(shí),隨著NaOH濃度的增加,瓊脂糖凝膠的活化密度逐漸增大,依次為33.53±0.10、37.32±0.87、39.43±0.56、44.34±0.62、45.91±078和49.51±0.75, NaOH濃度為3.5mol/l時(shí),活化基團(tuán)的密度達(dá)到最大,NaOH濃度為4.0mol/l時(shí),環(huán)氧基活化密度相比NaOH濃度為3.5mol/l無(wú)顯著差異(49.11±0.45,P=0.450.05)。 1.2ECH用量的影響 5份瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF樣品,在不同濃度(10%、20%、30%、40%和50%)的ECH條件下反應(yīng),環(huán)氧基的活化密度有顯著差異(方差齊,采用one-way ANOVA,F=400.13,P=0.00)。濃度從10%增加到30%時(shí),隨著ECH濃度增大,活化密度逐漸增高,依次為10%ECH,4.37±0.45;20%ECH,28.87±0.47;30%ECH,42.82±1.80。濃度為30%時(shí),活化密度最高,當(dāng)濃度超過(guò)30%時(shí),繼續(xù)增加ECH的濃度,活化密度不再增加,40%ECH組(41.71±1.98)和50%ECH組(41.78±1.59)的活化密度與30%ECH組相比,無(wú)顯著差異(40%ECH, P=0.360.05;50%ECH, P=0.390.05);40%ECH組和50%ECH組相比,無(wú)顯著差異(P=0.9530.05)。 1.3反應(yīng)時(shí)間的影響 4份瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF,分別反應(yīng)1h、2h、3h和4h后,結(jié)果顯示：瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基活化密度有顯著差異(方差齊,采用one-way ANOVA,F=113.123,P=0.00)。反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí),瓊脂糖凝膠的活化密度最大(41.78+0.23)；反應(yīng)時(shí)間為1h和3h次之(40.02±0.25,40.29±0.08),兩者無(wú)顯著性差異(P=0.2070.05)；4h時(shí)最低(38.17±0.34)。 1.4反應(yīng)溫度的影響 4份瓊脂糖凝膠樣品,在不同溫度條件下反應(yīng)(20℃、30℃、40℃、50℃)。結(jié)果顯示：瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基活化密度有顯著差異(方差齊,采用one-way ANOVA,F=337.817,P=0.00)。40℃時(shí)瓊脂糖凝膠Sepharose-6FF的活化密度最高(45.21±0.79),30℃次之(39.96±0.17),20℃處理組為(33.99±0.40),50℃處理組最低(27.66±1.11)。 2. NaIO4活化瓊脂糖凝膠條件的優(yōu)化 2.1NaIO4溶液濃度的影響 5份瓊脂糖凝膠樣品,在NaIO4溶液濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/I的條件下反應(yīng),結(jié)果顯示：各組樣品中醛基的活化密度有顯著差異(方差齊,采用one-way ANOVA, F=2100.896, P=0.00)。 NaIO4的濃度從0.05增加到0.1mol/l時(shí),瓊脂糖凝膠中醛基的活化密度隨著濃度增大而增加(0.05mol/l組,57.32±0.60；O.1mol/l組,109.42±0.85)。0.1mol/l時(shí),醛基的活化密度最大,0.2mol/l時(shí),相比0.1mol/l組醛基的活化密度降低,而從0.2到0.5mol/l之間,瓊脂糖凝膠中醛基的活化密度逐漸降低(0.2mol/l組,99.92±0.90；0.3mol/l組,95.25±0.24;0.4mol/l組,93.55±0.28；0.5mol/1組,91.88±0.82)。 2.2反應(yīng)溫度的影響 5份瓊脂糖凝膠樣品,分別在30℃、35℃和40℃的條件下反應(yīng),結(jié)果顯示：樣品中醛基的含量有顯著性差異(方差齊,采用one-way ANOVA,F=134.14,P=0.00)。35℃時(shí),醛基的活化密度最高(106.24±1.11),30℃次之(92.03±1.50),40℃時(shí)最低(85.41±2.02)。 2.3反應(yīng)時(shí)間的影響 5份瓊脂糖凝膠樣品,反應(yīng)時(shí)間分別為Ih、2h、3h、4h和5h。結(jié)果顯示：樣品中醛基的含量有顯著性差異(方差齊,采用one-way ANOVA,F=2206.16,P=0.00),反應(yīng)時(shí)間在1h到4h之間,醛基的活化密度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,依次為38.32±0.36,77.82±0.12,96.09±0.19和107.59±1.37。5h組與4h組的醛基的活化密度相比無(wú)顯著差異(5h,101.70±1.84,P=0.902)。 3.rSPA的用量對(duì)活化瓊脂的rSPA偶聯(lián)量和對(duì)免疫吸附劑的IgG的吸附量的影響 3.1rSPA的用量對(duì)活化瓊脂的rSPA偶聯(lián)量的影響 在不同rSPA用量條件下(1、2、3、4、5和6mg/g gel),未活化的瓊脂糖凝膠和rSPA不發(fā)生偶聯(lián),偶聯(lián)前后rSPA的量無(wú)變化,比較ECH法和NaIO4法活化的瓊脂糖凝膠的rSPA偶聯(lián)量(方差齊,one-way ANOVA)。rSPA加入量為1mg/g gel時(shí),ECH組(0.87±0.01)與NaIO4組(0.86±0.12)相比無(wú)顯著性差異(F=1.471,P=0.292); rSPA加入量為2mg/g gel時(shí),ECH組(1.77±0.02)明顯大于NaIO4組(1.27±0.05)(F=288.80,p=0.00); rSPA加入量為3mg/g gel時(shí),ECH組(2.82±0.05)明顯大于NaIO4組(1.80±0.02)(F=1224.01,p=0.00);rSPA加入量為4mg/g gel時(shí),ECH組(3.93±0.04)明顯大于NaIO4組(2.25±0.03)(F=3577.69, p=0.00); rSPA加入量為5mg/g gel時(shí),ECH組(4.91±0.35)明顯大于NaIO4組(2.77±0.51)(F=3572.88, p=0.00); rSPA加入量為6mg/g gel時(shí),ECH組(5.90±0.46)明顯大于NaI04組(3.31±0.17)(F=9384.50,p=0.00)。 3.2rSPA的用量對(duì)兩種免疫吸附劑的IgG的吸附量的影響 在不同rSPA用量條件下(1、2、3、4、5和6mg/g gel),兩種吸附劑對(duì)IgG的偶聯(lián)量有顯著差異(方差齊,one-way ANOVA方法)：rSPA加入量為1mg/g gel時(shí),ECH組(8.52±0.03)明顯小于NaIO4組(10.54±0.11)(F=881.46,P=0.00);rSPA加入量為2mg/g gel時(shí),ECH組(10.80±0.03)明顯小于NaIO4組(12.67±0.04)(F=3869.41,p=0.00); rSPA加入量為3mg/g gel時(shí),ECH組(15.37±0.05)明顯小于NaIO4組(18.87±0.09)(F=3744.41, p=0.00); rSPA加入量為4mg/g gel時(shí),ECH組(19.00±±0.10)明顯小于NaIO4組(20.29±±0.76)(F=336.04, p=0.00); rSPA加入量為5mg/g gel時(shí),ECH組(22.19±±0.28)明顯小于NaIO4組(23.01±0.21)(F=17.07, p=0.01); rSPA加入量為6mg/g gel時(shí),ECH組(23.73±±0.10)明顯小于NalO4組(24.49±±0.03)(F=173.86,p=0.00)。 4.不同的吸附劑對(duì)血漿蛋白的吸附量的比較 三種不同的吸附劑對(duì)血漿成分的吸附量有顯著差異(方差齊,one-way ANOVA, F=15313.06, P=0.00),其中用NaIO4法活化的吸附劑的IgG吸附量最大(21.49±±0.10)；ECH組次之為(20.04±0.08)；未活化瓊脂對(duì)IgG吸附量最低(3.54±0.03)。NaIO4制備吸附劑對(duì)IgM的吸附量(0.38±0.02)明顯大于ECH組(0.32±0.02)(方差齊,采用one-way ANOVA, F=13.50, P=0.020.05); NaIO4制備的吸附劑對(duì)IgA的吸附量(1.60±0.04)明顯大于NaIO4組(1.43±0.02)(方差齊,采用one-way ANOVA, F=11.95, P=0.030.05)。三種不同的吸附劑對(duì)非抗體成分白蛋白吸附量有顯著差異(方差齊,采用one-way ANOVA分析,F=229976.23, P=0.00), NaIO4組(18.53±±0.02,P=0.00)和ECH組(18.49±0.02,P=0.00)與未活化的瓊脂糖凝膠組(2.13±±0.03)相比均有顯著差異,但NaIO4組與ECH組之間相比無(wú)顯著差異(P=0.2010.05)。三者均對(duì)纖維蛋白原、甘油三脂、膽固醇、脂蛋白(高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)等成份的吸附力較弱。 5.ECH法和NaIO4法合成的兩種rSPA吸附劑的重復(fù)使用性的評(píng)估 重復(fù)使用10次后,ECH法和NaIO4法合成的兩種rSPA吸附劑對(duì)IgG的吸附能力沒(méi)有明顯的改變。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Mauchly's Test of Sphericity檢驗(yàn)(P=0.00),表明重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性,需要用repeated measures-ANOVA方差分析,結(jié)果顯示：使用10次所得的IgG吸附量之間無(wú)顯著差異(F=0.933,P=0.590.05)；不同的吸附劑對(duì)IgG的吸附量有明顯的差異(F=182.73,P=0.00),重復(fù)使用和不同吸附劑這兩個(gè)因素的交互作用也對(duì)IgG的吸附量無(wú)顯著影響(F=1.041,P=0.4270.05)；重復(fù)使用10次后,兩種吸附劑對(duì)IgG的吸附量沒(méi)有明顯的改變,始終維持在20mg/ml gel以上。 6.兩種rSPA吸附劑的rSPA脫落量的檢測(cè) ECH法合成的免疫吸附劑的SPA的脫落量(3.42±0.12)明顯小于NaIO4法(0.657±0.07)(方差齊,采用one-way ANOVA,F=1121.408,P=0.00)。 結(jié)論 1.ECH活化法的最佳條件分別是30%ECH、3.5mol/1NaOH、40℃和反應(yīng)2h。在最優(yōu)條件下,環(huán)氧基活化密度可達(dá)到65umol/ml左右。 2.NaIO4活化法的最佳條件分別是NaI04濃度為0.1mol/1、35℃、反應(yīng)4h。在最優(yōu)條件下,醛基的活化密度可達(dá)到120umol/ml左右。 3.在相同rSPA用量下,ECH活化的sepharose-6FF對(duì)SPA的偶聯(lián)量高于NaIO4活化的sepharose-6FF,但是NaI04活化法制備的吸附劑比ECH法對(duì)IgG的吸附量大。ECH活化法所制的吸附劑對(duì)IgG的吸附量可達(dá)到24mg/ml左右,NaIO4活化法所制的吸附劑可達(dá)到26mg/ml左右。 4.ECH法和NaI04法合成的兩種吸附劑對(duì)血漿中的抗體成分IgG、IgM和IgA都有明顯的吸附能力,并且NaI04法制備的吸附劑大于ECH法制備的吸附劑。兩者對(duì)白蛋白也有明顯的吸附能力,但是相互之間無(wú)差別。而對(duì)纖維蛋白原、甘油三脂、膽固醇、脂蛋白(高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)等非抗體成分的吸附力較差。 5.重復(fù)使用10次后,ECH法和NaIO4法合成的兩種吸附劑對(duì)IgG的吸附量都沒(méi)有明顯的改變,始終維持在20mg/ml gel以上。 6.ECH法合成的免疫吸附劑的rSPA的脫落量明顯小于NaIO4法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R914.5

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本文編號(hào)：2229856