發(fā)布時(shí)間：2018-07-25 20:56

【摘要】：微囊藻毒素(MCs)是一類(lèi)由淡水藍(lán)藻產(chǎn)生的環(huán)狀七肽天然毒素,具有強(qiáng)烈的肝、腎毒性。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中,率先發(fā)現(xiàn)MC-LR染毒后可顯著下調(diào)雄性小鼠睪酮水平并引發(fā)生精功能障礙。生精功能障礙嚴(yán)重影響人類(lèi)的生活健康,而睪酮分泌不足可導(dǎo)致男性生殖異常、心血管疾病、糖尿病及骨質(zhì)疏松癥等多種病癥。因此,探討MC-LR對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損傷,特別是引起睪酮水平顯著下調(diào)的機(jī)制,對(duì)評(píng)定MC-LR的雄性健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究了 MC-LR急性染毒后對(duì)雄性小鼠睪丸細(xì)胞致凋亡作用的機(jī)制;評(píng)估了 MC-LR對(duì)下丘腦-垂體-睪丸軸激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響,確認(rèn)了 MC-LR在下丘腦-垂體-睪丸軸激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的靶位點(diǎn);進(jìn)一步探討了 MC-LR對(duì)靶細(xì)胞-GnRH神經(jīng)元產(chǎn)生細(xì)胞毒性及影響其功能的分子機(jī)制。全文共分為三個(gè)部分:第一部分MC-LR急性染毒誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡機(jī)制探討一、目的檢測(cè)MC-LR急性染毒對(duì)雄性小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡的影響,并探討MC-LR誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的機(jī)制;建立MC-LR染毒大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydigcells)模型,研究MC-LR對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的影響。二、方法1、Balb/c 雄性成年小鼠腹腔注射 MC-LR(0,3.75,7.5,15,30μg/kg.b.w),連續(xù)注射1天,4天后,頸椎脫臼處死小鼠。組織切片觀察睪丸組織損傷情況,TUNEL染色檢測(cè)睪丸組織細(xì)胞凋亡情況。2、通過(guò) RT-PCR,檢測(cè)pp2A,p53,Bcl-2,Bax,Cyt-c,c-jun,c-fos,c-myc,Caspase 3,Caspase 8 表達(dá)水平。3、通過(guò) Western Blot,檢測(cè) PP2A/p-PP2A,p53/p-p53,Bcl-2/p-Bcl-2,Bax,Cyt-c,Caspase 3水平變化。4、MC-LR(0,1,10,100,250,500,750,1000 nM)染毒大鼠間質(zhì)細(xì)胞 48 h后,取2小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)睪酮濃度,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,FDA-PI雙染檢測(cè)細(xì)胞活率,免疫熒光示蹤MC-LR檢測(cè)MC-LR是否進(jìn)入間質(zhì)細(xì)胞。三、結(jié)果1、MC-LR染毒1天后,15和30μg/kg.b.w注射組,睪丸組織出現(xiàn)輕微的結(jié)構(gòu)松散,細(xì)胞脫落的狀況;MC-LR連續(xù)染毒4天后,7.5,15和30μg/kg.b.w注射組,睪丸組織均出現(xiàn)結(jié)構(gòu)松散,細(xì)胞脫落的狀況;30μg/kg.b.w注射組,曲細(xì)精管內(nèi)可觀察到明顯的精子數(shù)量減少。2、TUNEL檢測(cè)睪丸組織切片凋亡狀況,結(jié)果表明,隨著染毒劑量的加大和染毒時(shí)間的增加,睪丸組織細(xì)胞凋亡的比例顯著上升。提示MC-LR誘發(fā)睪丸細(xì)胞凋亡具有時(shí)間-劑量依賴性特點(diǎn)。3、RT-PCR結(jié)果表明,MC-LR可顯著上調(diào)凋亡相關(guān)分子Bax、caspase3,caspase 5表達(dá)水平,增殖相關(guān)因子c-myc,c-jun,c-fos表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果表明,MC-LR顯著上調(diào)p-p53及p-Bcl-2水平。MC-LR對(duì)睪丸組織Bcl-2的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。1、MC-LR染毒間質(zhì)細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)液中睪酮濃度沒(méi)有顯著變化,細(xì)胞活力及活率均沒(méi)有顯著變化;免疫熒光示蹤結(jié)果表明,MC-LR沒(méi)有進(jìn)入間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部。四、結(jié)論1、MC-LR進(jìn)入睪丸組織后,可誘發(fā)睪丸細(xì)胞凋亡,結(jié)構(gòu)損傷,繼而導(dǎo)致功能障礙。且MC-LR進(jìn)入組織后,通過(guò)與底物PP2A結(jié)合,上調(diào)磷酸化p53及磷酸化Bcl-2 水平,經(jīng)由Bax-Caspase通路引發(fā)細(xì)胞凋亡。2、MC-LR對(duì)睪酮合成細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性,不改變其合成睪酮的能力。第二部分MC-LR對(duì)下丘腦-垂體-睪丸軸激素軸的影響及作用靶點(diǎn)一、目的建立MC-LR染毒Balb/c小鼠、SD大鼠模型,檢測(cè)不同濃度MC-LR連續(xù)作用對(duì)下丘腦-垂體-睪丸軸的影響,評(píng)估MC-LR雄性內(nèi)分泌毒性。鑒定MC-LR在下丘腦、垂體組織中的分布;通過(guò)添加GnRH抑制劑或GnRH,確定MC-LR在下丘腦-垂體-睪丸軸的作用靶點(diǎn)。二、方法1、Balb/c雄性成年小鼠腹腔注射MC-LR(0,3.75,7.5,15,30μg/kg.b.w),連續(xù)注射1天,4天,7天,14天后,摘眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。檢測(cè)小鼠體重變化,檢測(cè)血清LH、FSH、睪酮變化;RT-PCR檢測(cè)下丘腦-垂體-睪睪 中主要分子 Kiss-1,GPR54,GnRH,GnRHr,LHβ,FSHβ,LHr,FSHr表達(dá)變化。2、檢測(cè)MC-LR對(duì)SD大鼠的LD50劑量�；贚D50,成年SD大鼠腹腔注射MC-LR30μg/kg.b.w,續(xù)注射1,3,5,7,14天后,眼球取血,頸椎脫臼處死小鼠。利用放免法檢測(cè)血清中GnRH、LH、FSH及睪酮水平;TUNEL法鑒定下丘腦細(xì)胞凋亡情況。3、MC-LR腹腔注射SD雄性大鼠(100μg/kg.b.w),動(dòng)物p死前頸椎脫臼處死。Western Blot鑒定MC-LR是否進(jìn)入下丘腦和垂體組織。免疫熒光共定位檢測(cè)MC-LR是否進(jìn)入下丘腦GnRH神經(jīng)元。4、體外培養(yǎng)GT1-7細(xì)胞系,免疫熒光染色GPR54和GnRH鑒定細(xì)胞。1000nM MC-LR染毒GT1-7細(xì)胞24小時(shí)后,免疫熒光鑒定MC-LR是否進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。5、成年SD大鼠皮下注射西曲瑞克(0.313,0.625,1.25mg/kg.b.w)12小時(shí),檢測(cè)LH、FSH轉(zhuǎn)錄及血清睪酮水平變化,選擇最有效作用濃度。6、基于上述實(shí)驗(yàn)中,成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 5天后血清中GnRH到達(dá)峰值,給予給藥動(dòng)物補(bǔ)注射GnRH抑制劑西曲瑞克;基于預(yù)實(shí)驗(yàn)中SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 14天后,GnRH水平顯著下降,給予給藥動(dòng)物補(bǔ)注射GnRH。摘眼球取血,檢測(cè)血清中LH、FSH和睪酮水平變化,判斷GnRH是否為MC-LR作用后,血清LH、FSH和睪酮變化的使動(dòng)因素。三、結(jié)果1、Balb/c 雄性成年小鼠腹腔注射 MC-LR(0,3.75,7.5,15,30 μg/kg.b.w)1,4,7天后,小鼠體重沒(méi)有發(fā)生顯著變化;注射14天后,30μg/kg.b.w組小鼠體重顯著下降。注射1天時(shí),30μg/kg.b.w組小鼠血清LH、睪酮均上升;注射4天后,15μg/kg.b.w組小鼠血清LH、FSH及睪酮水平也發(fā)生上升;而注射7天后,30 μg/kg.b.w組小鼠血清LH、FSH及睪酮出現(xiàn)輕微下降;注射14天后,所有MC-LR注射小鼠血清LH及睪酮顯著低于正常水平。RT-PCR結(jié)果顯示,MC-LR染毒沒(méi)有改變Kiss-1,GPR54,GnRHr,LHr,FSHr的表達(dá)水平;LHβ,FSHβ的表達(dá)水平與血清呈相同趨勢(shì),但GnRH表達(dá)水平隨著MC-LR染毒濃度和作用時(shí)間的加強(qiáng),顯著降低。2、SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30μg/kg.b.w染毒1,3,5天時(shí),血清中GnRH、LH、FSH、睪酮均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),第五天達(dá)到峰值;染毒7,14天時(shí),血清中GnRH、LH、FSH和睪酮均迅速下降,且4種激素變化趨勢(shì)一致。TUNEL法鑒定發(fā)現(xiàn),MC-LR染毒1,3,5天時(shí),沒(méi)有觀察到顯著的凋亡變化,而染毒7,14天時(shí),可觀察到下丘腦弓狀核和室前核明顯的細(xì)胞凋亡。3、MC-LR腹腔注射SD雄性大鼠(100 μg/kg.b.w)后,Western Blot檢驗(yàn)結(jié)合在PP蛋白上的MC-LR,結(jié)果表明MC-LR進(jìn)入下丘腦組織,不進(jìn)入垂體組織。下丘腦組織連續(xù)切片,通過(guò)免疫熒光示蹤,熒光標(biāo)記免疫M(jìn)C-LR及GnRH,結(jié)果可觀察到下丘腦存在MC-LR和GnRH雙陽(yáng)性的細(xì)胞,即MC-LR可有效進(jìn)入下丘腦GnRH神經(jīng)元。4、免疫熒光標(biāo)記GPR54和GnRH,觀察到細(xì)胞系雙陽(yáng)性,證明該細(xì)胞為GT1-7細(xì)胞,具有合成GnRH的能力。免疫熒光標(biāo)記MC-LR表明,MC-LR可有效進(jìn)入GT1-7細(xì)胞。5、通過(guò)檢測(cè)LH、FSH轉(zhuǎn)錄水平和血清睪酮水平,認(rèn)為西曲瑞克腹腔注射0.625 mg/kg.b.w12小時(shí)后,對(duì)LH、FSH及血清睪酮水平抑制最為顯著。6、成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR30 μg/kg.b.w 5天后,給藥動(dòng)物補(bǔ)注射GnRH抑制劑后,可觀察到血清中LH、FSH和睪酮均恢復(fù)到正常水平;7、成年SD雄性大鼠腹腔注射MC-LR 30 μg/kg.b.w 14天后,給藥動(dòng)物補(bǔ)注射GnRH,可觀察到血清中LH、FSH和睪酮恢復(fù)到正常水品。四、結(jié)論MC-LR在下丘腦-垂體-睪丸軸的作用靶點(diǎn)為GnRH神經(jīng)元,可導(dǎo)致GnRH轉(zhuǎn)錄水平的顯著下降,并導(dǎo)致GnRH釋放水平先升高后下降,進(jìn)而引發(fā)LH、FSH、睪酮水平同步先升高后下降。第三部分MC-LR對(duì)GT1-7細(xì)胞毒性和合成及分泌GnRH影響的分子機(jī)制一、目的建立GnRH神經(jīng)元細(xì)胞系(GT1-7 cells)模型,研究MC-LR對(duì)GT1-7細(xì)胞的影響;探索MC-LR對(duì)GT1-7細(xì)胞產(chǎn)生毒性的分子機(jī)制;探索MC-LR影響GT1-7細(xì)胞合成及分泌GnRH的分子機(jī)制。二、方法1、MC-LR(0,1,10,100,1000,10000nM)染毒 GT1-7 細(xì)胞 48h 后,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,LDH法檢測(cè)細(xì)胞膜泄露率,TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況。2、MC-LR1000nM染毒GT1-7細(xì)胞48 h后,采用凋亡抗體芯片技術(shù)篩選明顯變化的蛋白,Q-PCR法驗(yàn)證陽(yáng)性蛋白。3、MC-LR(0,1,10,100,1000,10000nM)染毒 GT1-7 細(xì)胞 48h 后,取 2小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)GnRH濃度,Q-PCR法檢測(cè)GnRH轉(zhuǎn)錄水平變化。Elisa法檢測(cè)細(xì)胞cAMP、Ca2+濃度,Elisa法檢測(cè)細(xì)胞AC的活力變化;Q-PCR法檢測(cè)GnRH轉(zhuǎn)錄因子Oct-1、Otx2、Pbx1α、Dlx2、Fos和Jun的表達(dá)變化。三、結(jié)果1、CCK-8及LDH結(jié)果表明,隨著MC-LR作用濃度升高,細(xì)胞活力顯著下降,LDH顯著上升;TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),MC-LR可顯著誘導(dǎo)GT1-7細(xì)胞凋亡。2、凋亡芯片結(jié)果表明,部分凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bid表達(dá)上調(diào),Bcl-2、Bcl-w、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4、IcIAP-2、sTNF-R1 和 sTNF-R2 表達(dá)下調(diào)。Q-PCR 檢驗(yàn)其中 Bcl-2、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4,結(jié)果與凋亡芯片結(jié)果相符。3、MC-LR染毒GT1-7細(xì)胞后,可觀察到細(xì)胞培養(yǎng)液中GnRH濃度隨MC-LR作用濃度的升高,呈先升高后下降的顯著趨勢(shì);Q-PCR結(jié)果表明,GnRH轉(zhuǎn)錄水平隨著MC-LR作用濃度升高顯著下降。細(xì)胞內(nèi)cAMP、Ca2+顯著上調(diào),AC活力顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子Oct-1、Otx2、Pbx1a、Dlx2顯著下調(diào),轉(zhuǎn)錄抑制因子fos顯著上調(diào),jun顯著下調(diào)。四、結(jié)論1、MC-LR對(duì)GT1-7細(xì)胞具有強(qiáng)烈毒性,可通過(guò)下調(diào)bcl-2、bcl-w、p53、IGF-2、IGFbp-2、IGFbp-4、IcIAP-2、sTNF-R1 和 sTNF-R2,上調(diào) bax 和 bid 誘發(fā)細(xì)胞凋亡。2、MC-LR 可下調(diào) GnRH 轉(zhuǎn)錄激活因子 Oct-1、Otx2、Pbx1a、D1x2,上調(diào) GnRH轉(zhuǎn)錄抑制因子c-jun水平,進(jìn)而引發(fā)GnRH轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。3、MC-LR顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平,激活A(yù)C,引發(fā)cAMP顯著增多,刺激GnRH釋放增加,并最終由于GnRH轉(zhuǎn)錄水平下降,GnRH釋放水平繼而下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R99

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本文編號(hào)：2145063