本文選題：烏司他丁 + 預(yù)先給藥��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 心臟缺血一段時間再恢復(fù)血流灌注后,其心肌細胞代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(]myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI),此現(xiàn)象主要在行體外循環(huán)的心臟手術(shù)、心肌梗死患者的溶栓治療和冠心病患者實施非心臟手術(shù)中較為多見,其可進一步使心臟的各種危險事件發(fā)生率升高。缺血再灌注損傷是一個多因素參與的復(fù)雜過程,而機制至今仍未闡明,其中氧自由基的大量產(chǎn)生及心肌細胞凋亡卻是造成損傷的重要因素。目前,活性氧(ROS)和氧自由基被認為是導(dǎo)致細胞凋亡的重要因素。在心臟缺血再灌注時產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷中,它們對心臟的病理生理改變起到至關(guān)重要的作用。因此,如何減少圍手術(shù)期氧自由基的產(chǎn)生和心肌細胞凋亡的發(fā)生是預(yù)防心肌缺血再灌注損傷、挽救患者生命的一個重要環(huán)節(jié),也是一項重的研究課題。 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種代謝性疾病,主要表現(xiàn)為患者體內(nèi)的糖代謝和胰島素分泌異常。糖尿病心臟病是由于患者處于持續(xù)高糖狀態(tài),心肌細胞過度地受到氧化應(yīng)激而發(fā)生凋亡,最終引起心功能的損傷。不少研究也表明,持續(xù)高糖環(huán)境時各種細胞凋亡信號通道被激活而誘發(fā)心肌細胞的凋亡。圍手術(shù)期的手術(shù)創(chuàng)傷產(chǎn)生的過度應(yīng)激反應(yīng)又可增加糖尿病患者圍手術(shù)期心臟危險事件的發(fā)生率,從而增加其致殘率和死亡率。 烏司他丁是一種蛋白酶抑制劑,臨床上應(yīng)用廣泛,如用于治療急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭、抵抗手術(shù)侵襲、改善手術(shù)預(yù)后、改善重要器官缺血再灌注損傷、器官移植手術(shù)、體外循環(huán)手術(shù)等方面。許多臨床及動物實驗發(fā)現(xiàn),烏司他丁可能通過改善心功能的損傷,減少氧自由基、炎癥介質(zhì)及細胞的凋亡等機制,從而對缺血再灌注性心肌損傷具有良好的保護作用。但目前關(guān)于烏司他丁對心肌缺血再灌注損傷的研究都處于體內(nèi)研究,未能排除神經(jīng)和體液的影響,其在離體心肌細胞凋亡方面的影響研究還未見報導(dǎo)。本課題旨在利用過氧化氫(H202)誘導(dǎo)性H9c2細胞氧化應(yīng)激損傷模型,在細胞水平模擬體內(nèi)心肌缺血再灌注時產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷,并觀察烏司他丁對高糖環(huán)境下H9c2細胞受到H2O2急性氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響,并初步探討其與PI3K/Akt、Erk及Jnk等信號通路的關(guān)系。 目的 ①通過對各種指標的檢測評估氧化應(yīng)激過程對H9c2細胞造成的損傷。 ②評價不同劑量的烏司他丁預(yù)先給藥對氧化應(yīng)激損傷后的H9c2細胞有無保護作用,并選擇最合適的劑量。 ③研究烏司他丁預(yù)先給藥對H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其機制：其是否具有抗凋亡作用；其是否通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax的表達來減少細胞凋亡；其是否與PI3K/Akt、Erk和Jnk等信號通路有關(guān)。④研究烏司他丁預(yù)先給藥對高糖孵育下心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。 方法： 1.細胞氧化應(yīng)激損傷模型制作： 于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)孵箱中,加入含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細胞株。待細胞的生長處于對數(shù)生長期時進行實驗處理,PBS液洗2次后隨機分組。氧化應(yīng)激組細胞加入含500μmol/L H2O2的低血清DMEM (2%FBS)培養(yǎng)液于孵箱中培養(yǎng)24h,正常對照組細胞只加入低血清DMEM (2%FBS)培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,處理結(jié)束后收集標本進行各種指標檢測。 2.分組 第一部分分組： 細胞于96孔板和6孔板內(nèi)培養(yǎng),然后隨機分為正常對照組(NC組)、氧化應(yīng)激模型組(H組)、烏司他丁組(U組)和烏司他丁預(yù)先給藥組(UH組)。實驗時換入2%低血清培養(yǎng)基,NC組換入低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；H組前24h低血清培養(yǎng)基培養(yǎng),后24h換入含500μmol/L H2O2的低血清培養(yǎng)基處理；U組換入含烏司他丁400U/ml低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；UH組前24h于含400U/ml烏司他丁的低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),后24h換入含400U/ml烏司他丁及500μmol/LH202低血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。各組細胞共48h實驗處理后收集標本。 第二部分分組： 細胞培養(yǎng)于6孔板和T-75培養(yǎng)瓶內(nèi),隨機分為正常對照組(NC組)、氧化應(yīng)激模型組(H組)、烏司他丁預(yù)先給藥組(UH組)、抑制劑+氧化應(yīng)激組(LYH組或PDH組)和抑制劑+烏司他丁預(yù)先給藥組(LYUH組或PDUH組)。LY294002和PD9059分別是PI3K/Akt信號通道和Erkl/2信號通道的特異性抑制劑。抑制劑+氧化應(yīng)激組在前24h加入含10μmol/L抑制劑低血清培養(yǎng)基處理,后24h換入含抑制劑及500μmol/L H2O2低血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；抑制劑+烏司他丁預(yù)先給藥組前24h加入含抑制劑及400U/ml烏司他丁的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng),后24h換入含抑制劑、400U/ml烏司他丁及500μmol/L H2O2低血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；其余各組的處理同第一部分。 第三部分分組： 細胞培養(yǎng)于96孔板和6孔板內(nèi),實驗隨機分6組：正常糖對照組(NC組)：低糖(5.5mmol/L)低血清(2%FBS)培養(yǎng)基孵育細胞48h；正常糖氧化應(yīng)激組(H組)：低血清培養(yǎng)基孵育24h后加500μmol/L H2O2繼續(xù)刺激24h；正常糖烏司他丁預(yù)先給藥組(UH組)：低血清培養(yǎng)基中加400U/ml UTI孵育24h后再加500μmol/L H2O2繼續(xù)刺激24h；高糖對照組(HC組)：換入(25mmol/L)高糖低血清培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育48h；高糖+氧化應(yīng)激組(HH組)：高糖低血清培養(yǎng)基先孵育24h后再加入500μmol/L H2O2繼續(xù)刺激24h；高糖+UTI+氧化應(yīng)激組(HUH組)：高糖低血清培養(yǎng)基中加400U/ml UTI孵育24h后再加500μmol/LH202繼續(xù)刺激24h。各組細胞共實驗處理48h后收集標本。 3.實驗指標及技術(shù) (1)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)于6孔板內(nèi)培養(yǎng)的心肌細胞經(jīng)實驗處理后,吉姆薩染色后于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)變化。 (2)MTT法測定細胞活力96孔板內(nèi)心肌細胞實驗處理后,每孔換入200μl的低血清培養(yǎng)液和5mg/ml MTT液20μl后繼續(xù)孵育4h,棄上清,分別再加入150、1DMSO液,輕輕震蕩10min后使紫色結(jié)晶充分溶解,酶標儀測定各孔波長在490nm(A490)的吸光度(OD值),細胞存活率計算公式：細胞存活率=OD處理組/OD正常組×100%。 (3) LDH、SOD、MDA與caspase-3檢測實驗處理后,收集各組96孔板中培養(yǎng)液,按LDH試劑盒的說明書進行檢測及計算。酶消化法收集實驗處理后各組6孔板中的細胞標本,BCA法或考馬斯藍法測定各組細胞的蛋白濃度,分別按SOD、MDA與caspase-3試劑盒的說明書進行檢測及計算。 14)流式細胞儀測定細胞凋亡率實驗處理后酶消化法收集細胞及培養(yǎng)液,于常溫離心機1000g離心5min,棄上清后PBS液重懸細胞再離心,重復(fù)2次,細胞再重懸后調(diào)整細胞計數(shù)至105個/ml,按Annexin V-FITC/PI雙標記法染色處理細胞后于流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。 (5) Western Blot方法測定蛋白表達量實驗處理后收集各組細胞標本,酶消化法收集并提取細胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取相同蛋白量樣品和上樣緩沖液調(diào)整到相同體積后上樣,于10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)法將分離的目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h左右后,對應(yīng)的一抗40C孵育過夜,洗滌后二抗室溫孵育1h, ECL顯色,于暗室中X光膠片曝光,預(yù)染蛋白Marker確定目的條帶。 結(jié)果 1.細胞形態(tài)的變化 吉姆薩染色后倒置顯微鏡下觀察：NC組細胞生長密度高,呈短梭型緊密生長,邊界清楚,貼壁較牢；氧化應(yīng)激H組細胞生長密度低,細胞間隙增寬,可見大片脫失區(qū),部分細胞收縮變圓,細胞核固縮呈深藍色,甚至可見細胞碎片；U組形態(tài)與NC組相似,而UH組細胞密度較H組高,脫失區(qū)面積小,細胞邊界較清楚。 2.細胞活力的變化 氧化應(yīng)激損傷可使細胞活力顯著下降,且隨著H202濃度升高,細胞活力逐漸降低。500μmol/L的H2O2濃度用作建立氧化應(yīng)激模型,其細胞活力較NC組的顯著降低,僅為NC組的52.7±0.7%(P=0.00)。烏司他丁與心肌細胞共同孵育下,隨著烏司他丁濃度的增加,藥物對心肌細胞增殖的抑制作用不斷增大,細胞活力逐漸降低。而與H組比較,400U/ml烏司他丁隨著預(yù)先給藥時間的延長,其細胞活力逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。 與低糖(5mmol/L)組比較,隨著糖濃度的增加,心肌細胞存活率逐漸下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00),具有濃度依賴性。與HH組比較,HUH組的細胞存活率明顯升高(P=0.00)。 3. LDH、SOD、MDA、caspase-3與細胞凋亡率的改變 與NC組比較,氧化應(yīng)激損傷可使培養(yǎng)液中LDH活力、細胞內(nèi)MDA含量、caspase-3表達及細胞凋亡率顯著增多,而細胞內(nèi)SOD活性下降,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與H組比較,烏司他丁預(yù)先給藥組培養(yǎng)液中LDH活力、細胞內(nèi)MDA含量、caspase-3表達及細胞凋亡率都明顯降低,細胞內(nèi)SOD活性升高(P0.01)。 4.高糖環(huán)境對心肌細胞氧化應(yīng)激損傷后MTT、LDH、SOD、MDA及細胞凋亡率的影響 與正常糖組比較,高糖環(huán)境可造成心肌細胞一定程度的損傷,細胞內(nèi)SOD活性降低而MDA含量增多(P0.01),而其他指標的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；高糖環(huán)境下過氧化氫誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激可導(dǎo)致明顯的細胞損傷,細胞存活率及細胞內(nèi)SOD活性下降,培養(yǎng)液中LDH活力、細胞內(nèi)MDA含量及凋亡率增多(P0.01)。與HH組比較,烏司他丁預(yù)先給藥組中的培養(yǎng)液LDH活力、細胞內(nèi)MDA含量及細胞凋亡率都明顯降低,而細胞內(nèi)SOD活性升高(P0.01)。 5.細胞內(nèi)目的蛋白表達的變化 Western結(jié)果顯示,與NC組比較,H組和UH組的bcl-2表達量顯著降低,bax及p-Jnk表達量增多,而總Jnk量無明顯差異,bcl-2/bax比值降低而p-Jnk/Jnk比值升高(P0.01)；與H組比較,UH組的bcl-2/bax比值升高而p-Jnk/Jnk比值降低(P0.01)。 加入PI3K/Akt特異性抑制劑組中,與NC組比較,其余各組的p-Akt的表達量均增多,而總Akt量無明顯差異,p-Akt/Akt比值升高(P0.01),其中HU組的值最大,LYHU組次之,隨后是LYH組及H組,組間差異明顯(P0.01)；LYHU組p-Akt/Akt比值較HU組的降低而較H組的升高(P0.01),故PI3K/Akt抑制劑未能完全阻斷烏司他丁引起的作用。 加入Erkl/2特異性抑制劑組中,與NC組比較,其余各組的p-Erkl/2的表達量均增多,而總Erkl/2量無明顯差異,p-Erk/Erk比值升高(P0.01),其中HU組的值最大,PDHU組次之,隨后是H組及PDH組,組間差異明顯(P0.01)；PDHU組p-Erk/Erk比值較HU組的降低而較H組的升高(P0.01),故Erkl/2抑制劑也未能完全阻斷烏司他丁引起的作用。 6.相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果表明,SOD活性與細胞存活率呈正相關(guān),與凋亡率、MDA含量及LDH活性呈負相關(guān)；而MDA含量與存活率呈負相關(guān),與凋亡率及LDH活力呈正相關(guān)(P0.01)。 結(jié)論 本實驗通過過氧化氫誘導(dǎo)心肌細胞造成氧化應(yīng)激損傷模型,模擬心肌缺血再灌注后細胞的氧化應(yīng)激損傷,通過觀察細胞形態(tài)及測定細胞存活率、抗氧化指標、細胞凋亡率及部分信號傳導(dǎo)通路蛋白的變化,得出如下結(jié)論： (1)氧化應(yīng)激對細胞造成明顯損傷,引起細胞形態(tài)改變,存活率降低,凋亡率增加。 (2)烏司他丁預(yù)先給藥對高糖和正常環(huán)境下的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷都有較好的保護作用。 (3)高糖環(huán)境培養(yǎng)對細胞有損傷作用,烏司他丁預(yù)先給藥對細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用主要表現(xiàn)為維持細胞活力,降低細胞凋亡率,提高細胞抗氧化能力。 (4)烏司他丁預(yù)先給藥對氧化應(yīng)激損傷細胞保護作用的機制： ①維持細胞活力,減少細胞內(nèi)LDH漏出,提高細胞內(nèi)SOD的活性而減少MDA的含量起到抗氧化作用,減少細胞凋亡率。 ②增加抗凋亡蛋白bcl-2的表達且減少促凋亡蛋白bax的表達,進而降低caspase-3活性,從而發(fā)揮抗細胞凋亡的保護作用。 ③可通過活化PI3K/Akt及Erkl/2信號通道而抑制Jnk信號通道的活性起保護作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

【參考文獻】

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本文編號：2088052