本文選題：分子動力學模擬 + 蛋白A��； 參考：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：近年來,抗體藥物的發(fā)展十分迅速,具有較高的社會效益和經(jīng)濟效益。而抗體藥物在生產(chǎn)過程中,下游的純化所使用的填料作為一種耗材,消耗量很大,而國外抗體親和填料產(chǎn)品價格較高,大大提高了抗體藥物的生產(chǎn)成本。其中市面上最常見的用于抗體純化的親和配體為金黃色葡萄球菌蛋白A,它是由5個高度同源的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的,這5個結(jié)構(gòu)域都可以獨立與抗體Fc片段及VH3亞類抗體Fab片段結(jié)合。其中D結(jié)構(gòu)域與抗體Fab片段結(jié)合的復合物晶體已被解析出來,本論文選用該復合物晶體作為模型,目的是通過分子動力學模擬,突變可能影響D結(jié)構(gòu)域與抗體結(jié)合的氨基酸殘基,增大D結(jié)構(gòu)域與Fab片段的結(jié)合能力。一方面是因為Fab段的結(jié)合研究較少,還有很大的研究空間;另一方面是因為結(jié)合Fab段的配體既可用于Ig G的純化,也可用于Ig M的純化,區(qū)別于在B結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)上開發(fā)的結(jié)合Fc片段的配體結(jié)合Ig M抗體量很低,不適用于Ig M純化的特點。而采用分子動力學模擬技術(shù)的優(yōu)勢在于,可以在實驗開始前對可能的結(jié)果進行預判,使實驗的進行更具有方向性。為達到以上研究目的,本論文按照以下方案實施:1.采用MD模擬,對蛋白A的D結(jié)構(gòu)域和Ig M抗體的復合物晶體進行模擬,找到可能阻礙D結(jié)構(gòu)域與抗體Ig M結(jié)合的氨基酸殘基位點,并對該位點進行突變改造,得到和抗體親和力更強的突變體結(jié)構(gòu)。2.因為曾有很多研究結(jié)果證明四聯(lián)體串聯(lián)配體對抗體的結(jié)合能力有明顯提高。在本研究中對改造后的突變體和它的四聯(lián)體進行大腸桿菌重組表達、中試發(fā)酵和純化,得到D結(jié)構(gòu)域和改造后的突變體蛋白,并比較突變體及其四聯(lián)體和D結(jié)構(gòu)域結(jié)合Ig G、Ig M抗體的能力。3.通過表面等離子共振技術(shù)(SPR)檢測,定量比較D結(jié)構(gòu)域、突變體單體和它的四聯(lián)體對Ig G和Ig M抗體的結(jié)合能力。得到結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和平衡解離常數(shù)等參數(shù)。4.把D結(jié)構(gòu)域、突變體和突變體的四聯(lián)體3種配體蛋白分別偶聯(lián)到NHS預活化的瓊脂糖基質(zhì)上,在色譜條件下檢驗并比較了幾種配體對Ig G、Ig M抗體的動態(tài)結(jié)合載量。通過上述實驗,我們得到以下研究成果:1.通過對D結(jié)構(gòu)域和Ig M復合物晶體結(jié)構(gòu)的分析,我們發(fā)現(xiàn)D結(jié)構(gòu)域上K46含有的正電荷對Ig M上K2589和R2611有阻礙結(jié)合的作用。我們嘗試把K46突變?yōu)镋46,因為E46帶有負電荷不與Ig M上的K2589和R2611排斥。對兩個結(jié)構(gòu)最小結(jié)構(gòu)體系的能量比較,可以得出結(jié)論K46E與Ig M的親和力要強于D結(jié)構(gòu)域。2.在對D結(jié)構(gòu)域、K46E和K46E突變體3種蛋白的純化過程中發(fā)現(xiàn),對大腸桿菌細胞破碎后的上清液進行等電點沉淀,沉淀可以在中性條件下復溶,經(jīng)過這一步驟的蛋白樣品更易被鎳柱結(jié)合。而這幾種蛋白配體被鎳柱結(jié)合后,四聯(lián)體的洗脫條件比D結(jié)構(gòu)域和K46E突變體2種蛋白溫和,在中性含有咪唑的溶液中可以被洗脫,而單體蛋白需要在酸性條件下才能被洗脫。3.SPR的檢測結(jié)果顯示,D結(jié)構(gòu)域和K46E相比,D結(jié)構(gòu)域與Ig M的結(jié)合為慢速結(jié)合,慢速解離;K46E與Ig M的結(jié)合為快速結(jié)合,快速解離,親和力明顯增大。這一變化可能有利于K46E作為配體,在純化抗體過程中增大純化載量,也可以增大填料使用過程中的線性流速。四聯(lián)體與Ig G、Ig M的結(jié)合速率、解離速率都明顯增大,親和力明顯增強。證明了四聯(lián)體作為配體的結(jié)合能力比單體強。4.從3種偶聯(lián)抗體親和層析填料純化Ig G和Ig M的結(jié)果,可以觀察到,K46E作為配體對Ig G的動態(tài)結(jié)合載量有明顯增加,而對Ig M的動態(tài)結(jié)合載量沒有明顯改變,而K46E四聯(lián)體對Ig G和Ig M的動態(tài)結(jié)合載量都有明顯增加。本論文提供了一種抗體親和層析填料開發(fā)策略,即在原有晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上采用分子動力學模擬對配體結(jié)構(gòu)進行改造,之后通過重組表達、發(fā)酵、純化得到原配體蛋白和突變體蛋白。通過SPR技術(shù)得到改造前和改造后的配體對抗體的親和能力的各項指標參數(shù),再通過偶聯(lián)填料基質(zhì)檢驗它們對抗體純化的能力。相信這一抗體親和層析填料開發(fā)策略也可以用于對蛋白A其它結(jié)構(gòu)域的改造,也有可能用于其它原理層析填料的開發(fā)。
[Abstract]:In recent years , the development of antibody medicine has been very rapid and has higher social benefit and economic benefit . In this paper , we find that the binding capacity of K46E to Ig M is stronger than that of monomer . The results show that the binding capacity of K46E and Ig M is stronger than that of monomer .
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R91

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本文編號：2080364