本文選題：Kallistatin + 血管生成　； 參考：《華僑大學》2014年博士論文

【摘要】：血管生成是一種重要生理活動現(xiàn)象，包括血管內(nèi)皮細胞的活化、增殖、遷移、血管基底膜破壞、形成新的血管和血管網(wǎng)，并且與已存在的血管網(wǎng)連接。尤其在實體瘤的生長過程中，血管生成為腫瘤的生長提供必要的營養(yǎng)供給。隨著腫瘤血管生成概念的提出，以腫瘤血管生成為藥物靶點，為抗癌藥物研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，開發(fā)應用高效的抑制腫瘤血管生成藥物在抗腫瘤治療中顯得尤為重要，成為當前抗腫瘤藥物研制的重要方向之一。 Kallistatin（Kal）又稱組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白，具有獨特的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性，隨后發(fā)現(xiàn)其參與高血壓、炎癥、血管生成、腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，是一個極具臨床應用前景的蛋白類藥物。目前對Kal抑制腫瘤新生血管生成和腫瘤生長的能力已被證實，但是其確切的分子作用機制尚不清楚，本研究將通過酵母菌發(fā)酵并純化得到重組Kallistatin蛋白（rhKal），通過體內(nèi)外的實驗研究驗證其抗腫瘤血管生成的藥理活性，并進一步研究其分子作用機制。 首先將含有pPIC9-Kal質(zhì)粒的GS115(His4)菌體，用甲醇誘導培養(yǎng)基誘導表達，離心后留上清，然后經(jīng)過疏水作用（Phenylsepharose TM）、凝膠過濾層析（Sephade TMG-25）和親和層析（Heparin Sepharose）分離純化制備出rhKal蛋白純品，并進行驗證。其次，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）為研究對象，通過體內(nèi)外的實驗研究，考察在血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）刺激作用下，人源重組Kallistatin對HUVEC增殖、遷移、侵襲、小管生成等生物活性的影響，，并初步研究了rhKal對VEGF介導的VEGFR-2受體活性及下游信號通路活化的影響，進而了解rhKal抗血管生成的分子機制。再次，為了明確rhKal對腫瘤血管生成的影響，體外模擬了腫瘤環(huán)境，體內(nèi)外實驗觀察rhKal對乳腺癌MCF-7細胞株刺激的HUVEC血管生成的作用，進一步研究了人源重組Kal抗腫瘤血管作用與NF-κB信號通路之間的關(guān)系。通過檢測了不同濃度rhKal對乳腺癌MCF-7細胞和HUVEC細胞P65、I-κBα、磷酸化I-κBα、IKK蛋白及其磷酸化的影響，進一步利用western-blotting法檢測P65、P50核轉(zhuǎn)位變化，利用報告基因技術(shù)研究對P65蛋白轉(zhuǎn)錄活化的影響；同時檢測了rhKal對NF-κB傳導通路調(diào)節(jié)的血管生成相關(guān)基表達的影響。最后，為了進一步驗證rhKal抗血管生成作用和NF-κB之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了p65基因真核表達質(zhì)粒，分別導入乳腺癌MCF-7細胞和HUVEC細胞，觀察外源性p65基因?qū)毎蛲�、侵襲，以及對rhKal蛋白抑制血管生成相關(guān)基因的影響。 以上的研究結(jié)果表明，rhKal明顯抑制了VEGF誘導的血管生成，其分子機制部分可能與阻斷了VEGFR-2信號通路相關(guān)；在體外腫瘤環(huán)境中，rhKal同樣可以抑制了乳腺癌細胞對血管生成的促進作用，其分子機制可能與rhKal阻斷了NF-κB信號通路相關(guān)，從而抑制了其下游與血管生成相關(guān)靶基因的表達。綜上所述，整體結(jié)果表明rhKal具有明顯的抗腫瘤血管作用，是一個極具應用前途的抗腫瘤血管生成作用蛋白類藥物。
[Abstract]:angiogenesis is an important physiological activity phenomenon , including activation , proliferation , migration of vascular endothelial cells , destruction of vascular basement membrane , formation of new blood vessel and vascular network , and connection with existing vascular network .

Kallistatin ( Kal ) , also known as the kallistatin ( Kal ) , has a unique serine protease inhibitor activity , and has been found to be involved in the development and development of various diseases such as hypertension , inflammation , angiogenesis , tumor , etc .

The effects of rhKal on the proliferation , migration , invasion and formation of vascular endothelial growth factor ( VEGF ) in human breast cancer MCF - 7 cells were investigated .
Finally , in order to further verify the relationship between rhKal anti - angiogenic effect and NF - 魏B , we constructed a eukaryotic expression plasmid of p65 gene , introduced into MCF - 7 cells and HUVEC cells of breast cancer , respectively , observed the effects of exogenous PKP gene on apoptosis , invasion and inhibition of angiogenesis - related genes .

The results showed that rhKal inhibited VEGF - induced angiogenesis , and its molecular mechanism might be related to the blocking of VEGFR - 2 signaling pathway .
In conclusion , rhKal can inhibit angiogenesis in breast cancer cells . The molecular mechanism of rhKal can block the expression of NF - 魏B signal pathway downstream from rhKal . In conclusion , it is shown that rhKal has obvious anti - tumor angiogenesis and is a promising anti - tumor angiogenesis agent .
【學位授予單位】：華僑大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：TQ460.1;R96

【參考文獻】

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本文編號：2058157