本文選題：親環(huán)素A + 環(huán)孢菌素A��； 參考：《中國(guó)抗生素雜志》2017年10期

【摘要】：目的親環(huán)素A是免疫抑制劑環(huán)孢菌素A的胞內(nèi)受體,與多種重要生理和病理過(guò)程密切相關(guān),已經(jīng)成為如免疫抑制、病毒感染和炎癥等多類疾病的重要研發(fā)靶點(diǎn)。為了篩選新型小分子CypA抑制劑藥物,本研究建立了一個(gè)基于熒光偏振方法的CypA抑制劑藥物高通量篩選模型。方法應(yīng)用PCR方法從人外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增cypA基因,通過(guò)大腸埃希菌系統(tǒng)重組表達(dá)CypA蛋白,并利用鎳離子螯合親和層析柱進(jìn)行蛋白純化,以FITC標(biāo)記CsA為示蹤劑建立CypA抑制劑的篩選方法。結(jié)果 SDSPAGE檢測(cè)重組表達(dá)的CypA蛋白純度大于95%。經(jīng)過(guò)熒光偏振測(cè)定體系中示蹤劑FITC標(biāo)記CsA和重組CypA濃度的優(yōu)化,確定了最佳的熒光偏振反應(yīng)條件,使其信號(hào)本底比大于2.0,Z'因子為0.71。陽(yáng)性藥CsA能劑量依賴地與熒光標(biāo)記的CsA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于CypA,其IC50值為221.3nmol/L。利用建立的篩選模型,對(duì)28215個(gè)微生物次生代謝產(chǎn)物粗提物進(jìn)行了初篩和復(fù)篩,從中篩選得到43個(gè)抑制率大于80%的樣品。經(jīng)液相-質(zhì)譜方法進(jìn)一步分析,其中17個(gè)真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中含有環(huán)孢菌素類似物。結(jié)論本研究采用熒光偏振方法定量測(cè)定微生物代謝產(chǎn)物與熒光標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CypA,可以簡(jiǎn)單、快捷地進(jìn)行CypA抑制劑藥物或環(huán)孢菌素產(chǎn)生菌的高通量篩選,為后期的藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective Cyclophile A is the intracellular receptor of cyclosporin A, which is closely related to many important physiological and pathological processes and has become an important research and development target for many diseases such as immunosuppression, viral infection and inflammation. In order to screen novel small molecular CypA inhibitors, a high throughput screening model of CypA inhibitors was established based on fluorescence polarization method. Methods the cypA gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by polymerase chain reaction. CypA protein was expressed by Escherichia coli system and purified by nickel ion chelating affinity chromatography. Using FITC labeled CSA as tracer, the screening method of CypA inhibitor was established. Results the purity of CypA protein expressed by SDSPAGE was higher than 95%. By optimizing the concentration of FITC labeled CSA and recombinant CypA in the system of fluorescence polarization determination, the optimum conditions of fluorescence polarization reaction were determined, and the signal background ratio was greater than 2.0% Z' factor was 0.71. The positive drug CSA could compete with fluorescent labeled CSA in a dose-dependent manner and its IC50 was 221.3 nmol / L. With the established screening model, the crude extracts of 28215 microbial secondary metabolites were screened and rescreened, and 43 samples with inhibition rate of more than 80% were obtained. Further analysis by liquid phase mass spectrometry showed that the fermentation products of 17 fungi contained cyclosporin analogs. Conclusion in this study, the fluorescence polarization method for quantitative determination of microbial metabolites and fluorescent labeled probes combined with CypA can be used to screen CypA inhibitor drugs or cyclosporin producing bacteria in high throughput. To lay the foundation for the later stage of drug research and development.
【作者單位】： 華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國(guó)家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心新藥篩選石家莊市工程實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：基金項(xiàng)目:微生物來(lái)源藥物發(fā)酵及分離純化中試條件建設(shè)及質(zhì)量管理體系建設(shè)(No.169676404G)
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2045163