發(fā)布時間：2018-06-13 15:20

  本文選題：小干擾RNA + 細胞穿膜肽��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:近年來,RNA干擾在基因功能和基因治療方面的研究較為廣泛,已逐漸發(fā)展為一種較成熟的技術。RNA干擾是一種特異性細胞后轉錄機制,通過誘發(fā)相應mRNA的酶降解發(fā)揮基因沉默作用。雙鏈小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)是RNA干擾的效應分子之一,理論上可抑制任何靶基因表達,已被列為基因型疾病的潛在治療劑。但是,裸露的siRNA進入血清易被核酸酶降解,且siRNA帶負電荷,親水性強,導致其不易透過細胞膜進入細胞質發(fā)揮高效的RNAi作用。因此,siRNA應用的關鍵在于尋找安全、有效的遞送載體。目前已有很多載體用于改善siRNA的核酸酶抗性而又不干擾其沉默效率。其中,細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)作為基因遞送載體被廣泛研究且表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。細胞穿膜肽通常由5~30個氨基酸構成,是一類能攜帶大分子物質進入細胞的陽離子或兩親性短肽。它可將不同的貨物分子轉運到細胞和組織中而不引起顯著毒副作用。本文擬構建一種可以包載核酸類藥物siRNA并提高其轉染效果的納米復合物。首先選取細胞穿膜肽中的八聚精氨酸(R8)作為siRNA的基本載體,采用硬脂酸和聚乙二醇對其進行修飾,合成出幾種載體材料。再將載體材料與siRNA孵育制備成納米復合物。然后,通過納米粒度和zeta電位分析儀及瓊脂糖凝膠電泳試驗考察納米復合物的理化性質和包載能力,從而篩選出能夠縮合并遞送siRNA入胞的復合物。最后,以MCF-7、A549為模型細胞進行細胞攝取試驗,通過與市售產品(Lipofectamine2000)作比較,考察自制復合物介導siRNA入胞的效果。方法:1載體合成:首先,合成SA-R8。先制備SA活化反應液,再取SA活化液加入到R8溶液中反應30min,然后將反應液以純凈水為透析液透析24 h,透析結束后取少量透析液進行質譜分析。接著,用合成的SA-R8與mPEG2000-Mal和mPEG5000-Mal反應合成SA-R8-PEG,同樣將反應液以純凈水為透析液透析純化,然后取適量透析液質譜檢測。2復合物制備及評價:合成的載體材料具備兩親性,在極性溶劑中能自組裝成納米粒;八聚精氨酸(r8)帶正電荷,可通過靜電相互作用縮合帶負電荷的sirna�；谝陨显�,首先,用depc水溶解載體材料使自組裝成空白納米粒,隨后加入藥物sirna渦旋靜置,制備載sirna的納米復合物。然后,通過納米粒度和zeta電位分析儀對復合物的粒徑、電位進行測定。接著,通過瓊脂糖凝膠電泳試驗對復合物包載sirna的能力進行考察。根據(jù)考察結果,篩選出粒徑、電位合適且能夠完全包載sirna的復合物。最后,以mcf-7和a549兩種細胞為模型細胞,將篩選出的最佳復合物與游離sirna和市售產品(lipofectamine2000)一同給藥進行細胞攝取試驗,通過流式細胞分析儀定量檢測及評價自制復合物的細胞轉染效果。結果:質譜檢測結果顯示,合成的sa-r8、sa-r8-peg2000和sa-r8-peg5000實際分子量與理論值一致或相近;復合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna的平均粒徑在300~400nm之間,復合物(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/sirna平均粒徑在500~800nm之間,隨著n/p比的增大,兩者zeta電位從負變?yōu)檎?瓊脂糖凝膠電泳試驗顯示,兩種復合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna和(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/sirna均在n/p比為20:1時完全包載sirna;細胞攝取試驗分析顯示兩種納米復合物能夠成功地將sirna轉染到腫瘤細胞;且自制載體sr/srp2k介導sirna轉染細胞能力與市售產品(lipofectamine2000)不存在統(tǒng)計學差異(p0.05)。結論:1本文成功合成了載體材料sa-r8-peg2000和sa-r8-peg5000,且方法簡便易行,重現(xiàn)性較好。2通過靜電相互作用成功制備了載sirna的納米復合物,且方法操作簡便,重現(xiàn)性較好。通過粒徑、電位的測定及凝膠電泳試驗證明復合物能夠成功包載模型藥物sirna。3細胞攝取試驗表明,相比游離sirna,當n/p為20:1時,兩種復合物(sa-r8/sa-r8-peg200020%)/sirna和(sa-r8/sa-r8-peg500020%)/siRNA明顯提高了siRNA的細胞攝取;且自制載體SR/SRP2K(載體SA-R8/SA-R8-PEG200020%的縮寫)的siRNA細胞轉染效果達到市售產品(Lipofectamine 2000)水平。今后將繼續(xù)對該遞藥系統(tǒng)的處方、工藝進行優(yōu)化,進一步提高其轉染效率,以期為腫瘤治療提供新的方法。
[Abstract]:In recent years , RNA interference has been widely studied in gene therapy and gene therapy , and it has been developed into a more mature technology . The particle size and potential of the complexes were determined by using nano - particle size and zeta potential analyzer .
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R943

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陳中華;朱德生;李軍;黃展勤;;非病毒siRNA載體研究進展[J];中國藥理學通報;2015年07期

相關博士學位論文 前1條

1 李玉環(huán);靶向survivin的siRNA及其改性穿膜肽納米給藥系統(tǒng)的研究[D];吉林大學;2016年

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本文編號：2014465