本文選題：腫瘤滲透性多肽 + iRGD��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一,具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)。常規(guī)的治療方案包括手術(shù)切除、放療或化療,但是均難以取得理想的治療效果。除傳統(tǒng)的化療藥物之外,近年來臨床上已經(jīng)開始應(yīng)用腫瘤靶向治療藥物,包括小分子靶向藥物和納米藥物。與傳統(tǒng)化療方法相比,靶向藥物具有更強(qiáng)的治療效果和更小的毒副作用。但是目前應(yīng)用的靶向治療藥物也存在一定的缺陷,比如藥物在腫瘤組織中的滲透能力較弱,不能到達(dá)深層的腫瘤組織實(shí)質(zhì)。iRGD (internalizing RGD, CRGDK/RGPD/EC),又稱為內(nèi)化RGD,是近年來研究的一個(gè)熱點(diǎn),與傳統(tǒng)RGD相比,具有更強(qiáng)的腫瘤滲透能力。本課題組在前期的研究中,以PEG化聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(PEG-PAMAM)為骨架材料,阿霉素(Doxorubicin,DOX)為模型藥物,通過酸敏感的順式烏頭酸酐(Cis-acotonic anhydride, CA)與聚合物共價(jià)結(jié)合,制得PEG-PAMAM-cis-aconityl-DOX (PPCD)復(fù)合物,并以RGD (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)為主動靶向頭基,進(jìn)行共價(jià)修飾,制得主動靶向RGD-PEG-PAMAM-cis-aconityl-DOX (RGD-PPCD)納米復(fù)合物遞藥系統(tǒng),研究顯示具有較好的抗腫瘤效果。本課題將以iRGD替代RGD,合成iRGD-PEG-PAMAM-cis-aconityl-DOX (iRGD-PPCD)納米復(fù)合物遞藥系統(tǒng)�？疾炫c傳統(tǒng)RGD介導(dǎo)的復(fù)合物相比,iRGD介導(dǎo)的PPCD(包括iRGD-PPCD以及iRGD與PPCD聯(lián)合給藥)體內(nèi)外抗腫瘤的優(yōu)勢,并探討其作用機(jī)理。另外,局部給藥也是一種增加藥物在腫瘤組織蓄積的有效途徑,本課題組前期制備了DOX、RGD修飾和未修飾PPCD的緩釋植入片,本研究將初步探討其體內(nèi)外行為,為iRGD-PPCD緩釋植入片的研究打下基礎(chǔ)。1.本課題首先以雙功能的MAL-PEG-NHS (Mw 5000)和iRGD對第四代PAMAM進(jìn)行共價(jià)修飾,得到iRGD-PEG-PAMAM,通過酸酐的氨解反應(yīng)制備DOX的順式烏頭酸酐衍生物(CAD),經(jīng)過活化后與iRGD-PEG-PAMAM偶聯(lián),制備得到iRGD-PPCD。復(fù)合物表征結(jié)果表明,iRGD-PPCD中每個(gè)PAMAM分子表面偶聯(lián)有20.5個(gè)PEG分子,10.1個(gè)iRGD分子和11.9個(gè)DOX分子,粒徑為20.11±1.07 nm, Zeta電位為2.45±0.25 mV。iRGD-PPCD在pH為4.5、5.5、6.5和7.4的條件下,96h累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)分別為58.74±3.76%、15.03士2.67%、6.88±1.51%和2.64±0.66%,表明iRGD-PPCD具有酸敏感的釋放特征。同時(shí)按照本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法合成了復(fù)合物PPCD和RGD-PPCD,表征結(jié)果與iRGD-PPCD基本相一致,為后續(xù)的比較研究提供了合理性。2.根據(jù)C6,F98,B16,U87四種腫瘤細(xì)胞中,C6細(xì)胞表達(dá)整合素αv和NRP-1受體的量最大,選擇C6細(xì)胞為體內(nèi)外研究的細(xì)胞模型。偶聯(lián)RGD或iRGD增強(qiáng)了PPCD對C6的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取能力。iRGD-PPCD,RGD-PPCD, PPCD的IC50值分別為0.96M、1.21μM、2.40μM。與PPCD相比,C6細(xì)胞對iRGD-PPCD和RGD-PPCD的總攝取分別增加了29%和26%,內(nèi)吞分別增加了67%和59%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,iRGD-PPCD和RGD-PPCD的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取沒有顯著性差異。此外,iRGD或RGD與PPCD聯(lián)合給藥沒有改變PPCD的細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取量。研究結(jié)果還顯示,RGD和iRGD均能降低C6細(xì)胞對RGD-PPCD和iRGD-PPCD的攝取,表明細(xì)胞的吸附和內(nèi)吞具有配體-受體相互作用。在腫瘤球滲透實(shí)驗(yàn)中,與RGD-PPCD相比,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD的腫瘤球滲透深度分別從115.0μm增加到144μm和150μm,腫瘤球中間斷層藥物的熒光強(qiáng)度分別增加了54%和38%,表明iRGD介導(dǎo)的復(fù)合物具有更強(qiáng)的腫瘤球滲透能力。3.建立ICR小鼠的C6皮下瘤模型,采用熒光共聚焦顯微鏡(FCFM) Cell-viZio考察DOX復(fù)合物對腫瘤血管滲透性、密度和直徑的影響。腫瘤血管滲透性實(shí)驗(yàn)表明,不同給藥組腫瘤血管的滲透性存在明顯差別�？瞻捉M和DOX原藥組的腫瘤血管滲透性最弱；而PPCD,RGD+PPCD,RGD-PPC D組腫瘤血管的滲透性有一定的增強(qiáng)；iRGD+PPCD和iRGD-PPCD組的腫瘤血管滲透性最強(qiáng)。另外腫瘤血管抑制實(shí)驗(yàn)表明,與生理鹽水組相比,DOX,PPCD和RGD+PPCD組腫瘤血管密度和平均直徑?jīng)]有顯著性改變,而RGD-PPCD給藥組有顯著性降低,與RGD-PPCD給藥組相比,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD組腫瘤血管密度分別降低了30.8%和24.0%,平均直徑分別降低了29.1%和21.3%。4.以ICR小鼠C6原位腦膠質(zhì)瘤為模型,對DOX及其復(fù)合物的組織分布和藥效學(xué)等進(jìn)行評價(jià)。藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,與DOX原藥相比,各復(fù)合物均表現(xiàn)出明顯的長循環(huán)特征,主要表現(xiàn)為AUC、T1/2和MRT顯著增加,Vc和CL顯著減小。組織分布實(shí)驗(yàn)顯示,PPCD、RGD+PPCD、RGD-PPCD、iRGDPPCD和iRGD+ PPCD在腫瘤組織的AUC分別是DOX的8.2、8.8、10.5、13.7和14.7倍。其中,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD在腫瘤組織的AUC分別是RGD-PPCD的1.4和1.3倍。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,與RGD介導(dǎo)的復(fù)合物相比,iRGD介導(dǎo)的復(fù)合物能夠顯著增強(qiáng)藥物在腫瘤組織的分布,在瘤內(nèi)分布范圍較廣,滲透的區(qū)域離血管更遠(yuǎn)。藥效學(xué)結(jié)果顯示,iRGD+PPCD、iRGD-PPCD和RGD-PPCD的中位生存期分別是61天,57.5和43.5天。與R GD-PPCD組相比,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD組的生存期分別延長了40.2%和32.2%。HE染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)表明iRGD+PPCD和iRGD-PPCD治療組腫瘤細(xì)胞核皺縮最為明顯,腫瘤細(xì)胞數(shù)目最少,淡紅色胞漿面積最大,細(xì)胞間隙最大,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力最強(qiáng)。5.基于課題組前期研究,以PLGA/PLA/PEG為載體,采用溶劑揮發(fā)法,制備了DOX-PPCD和RGD-PPCD的緩釋植入片,對其進(jìn)行了體內(nèi)外行為的研究。植入片在pH 5.5和pH 7.4 PBS緩沖液中的體外釋放實(shí)驗(yàn)表明DOX及其復(fù)合物的PLGA/PLA/PEG植入片的體外釋放行為與釋放介質(zhì)的pH和所載的藥物無關(guān)。釋放曲線由遲釋段,快速釋放段和平臺期組成,其中快速釋放段符合零級釋藥模型。60天內(nèi)的平均累計(jì)釋放量為63.4%,表明植入片具有明顯的緩釋特征。測定釋放介質(zhì)中的游離藥物的釋放量證實(shí)包載在植入片中的DOX復(fù)合物仍然保持酸敏感釋藥特性。采用活體成像實(shí)驗(yàn)考查植入片的體內(nèi)行為。在給藥第7d,30d,45d的藥物擴(kuò)散面積分別是開始植入藥物時(shí)的1.31,1.69和2.26倍,表明藥物在體內(nèi)是不斷從植入片中滲透出來,擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤組織的。本課題構(gòu)建了iRGD-PPCD納米復(fù)合物遞藥系統(tǒng)。同時(shí)對iRGD及RGD介導(dǎo)的PPCD聚合物的抗腫瘤效果進(jìn)行比較研究,一系列的體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)：與傳統(tǒng)RGD介導(dǎo)的復(fù)合物相比,iRGD介導(dǎo)的復(fù)合物能顯著增強(qiáng)腫瘤血管的滲透性、抑制腫瘤血管的生長,具有更強(qiáng)的腫瘤滲透能力,從而進(jìn)一步提高抗腫瘤活性。此外,本課題還初步探討了局部緩釋植入片的體內(nèi)外行為及其機(jī)理。
[Abstract]:In this study , it is an effective way to treat tumor tissue . In addition , it is an effective way to improve tumor tissue accumulation . In addition , it is an effective way to improve tumor tissue accumulation . The results showed that the IC50 values of RGD - PPCD and RGD - PPCD were 58.74 鹵 3.76 % , 15.03 鹵 2.67 % , 6.88 鹵 1 . 51 % and 2.64 鹵 0.66 % , respectively .
PPCD , RGD + PPCD and RGD - PPC group D had some enhancement in the permeability of tumor vessels .
The tumor vessel density and average diameter of RGD - PPCD and RGD - PPCD group were significantly decreased compared with those of RGD - PPCD and RGD - PPCD .
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R96

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