本文選題：達(dá)沙替尼(Dasatinib) + 自噬�。� 參考：《浙江大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 達(dá)沙替尼(Dasatinib)是臨床用于治療伊馬替尼耐藥的慢性粒性白血病(CML)的抗腫瘤藥物,為第二代小分子酪氨酸激酶抑制劑,同時(shí)正處于非小細(xì)胞肺癌的Ⅱ期臨床研究。但Dasatinib的肝臟毒性是其嚴(yán)重的不良反應(yīng)之一,極大的限制了Dasatinib的臨床應(yīng)用,深入研究Dasatinib肝臟毒性的分子機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn)具有深遠(yuǎn)的意義。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí),能引起肝臟細(xì)胞發(fā)生自噬。因此,本課題旨在研究自噬在Dasatinib肝臟毒性中的作用,進(jìn)一步探索自噬發(fā)生的機(jī)制,并尋找可以保護(hù)Dasatinib誘導(dǎo)的肝臟毒性的小分子抑制劑,為Dasatinib肝臟毒性的保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),拓展其臨床應(yīng)用的廣度和深度。 方法： 采用裸小鼠移植瘤模型、ICR小鼠模型、大鼠原代肝臟細(xì)胞和永生化的人肝臟細(xì)胞Chang Liver,確證Dasatinib在臨床治療劑量下誘導(dǎo)肝臟毒性的同時(shí)可以激活自噬,并探討其對(duì)達(dá)沙替尼誘導(dǎo)的肝臟毒性的影響。(1)采用ICR小鼠模型,灌胃給予臨床治療CML劑量的Dasatinib30天后,通過檢測血清中血液生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和HE染色法,研究Dasatinib引起的肝臟毒性。(2)采用A549裸小鼠移植瘤模型,灌胃給予臨床治療實(shí)體瘤劑量的Dasatinib,30天后從瘤重、腫瘤體積(TV)相對(duì)腫瘤體積(RTV)等方面評(píng)價(jià)Dasatinib的抗腫瘤效果。(3)檢測Dasatinib給藥后的血液生化指標(biāo)ALT、AST和LDH的變化,并采用肝組織切片HE染色法,探索Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤藥效時(shí)的肝臟毒性。(4)采用免疫透射電鏡(TEM)、組織勻漿Western Blot法檢測肝組織中的自噬。(5)體內(nèi)給予營養(yǎng)劑與Dasatinib共同作用ICR小鼠,比較攝食量的變化,采用組織勻漿Western Blot、血液生化檢測和肝組織切片HE染色探索自噬發(fā)生的來源。(6)體外選用大鼠原代肝臟細(xì)胞,給予Dasatinib不同濃度和不同作用時(shí)間的處理,運(yùn)用AO染色法、MDC染色法和Western Blot法研究自噬在Dasatinib肝臟毒性中的發(fā)生,并選用Western Blot法在永生化人肝臟細(xì)胞Chang Liver中確證自噬的發(fā)生。(7)體內(nèi)選用ICR小鼠,給予Dasatinib作用1到4周,每周處死4只,采用血液生化指標(biāo)、HE染色和Western Blot法分析自噬與Dasatinib肝臟毒性出現(xiàn)的先后順序。(8)體外選用大鼠原代肝臟細(xì)胞和永生化的人肝臟細(xì)胞Chang Liver,給予3-MA和Dasatinib共同作用細(xì)胞,采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化,同時(shí)用Western Blot法檢測細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白LC3II/I、c-PARP、c-caspase-3的變化。(9)運(yùn)用小分子RNA干擾技術(shù),沉默大鼠原代肝臟細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白ATG-5,給予Dasatinib處理后24h,采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化,并用Western Blot法檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白LC3II/I、c-PARP、c-caspase-3的表達(dá)情況。(10)體內(nèi)采用ICR小鼠模型,給予3-MA和Dasatinib聯(lián)合給藥,30天后比較各組小鼠體重和死亡情況,采用TEM觀察肝組織自噬的變化,同時(shí)檢測血液生化指標(biāo)ALT、AST和LDH的變化,并選取肝組織切片HE染色法,研究抑制自噬對(duì)Dasatinib誘導(dǎo)的肝臟毒性的影響。 采用大鼠原代肝臟細(xì)胞和永生化的人肝臟細(xì)胞Chang Liver,在體外探索自噬調(diào)控Dasatinib肝臟毒性的分子機(jī)制,并尋找干預(yù)靶點(diǎn)的小分子抑制劑。(1)采用大鼠原代肝臟細(xì)胞和永生化的人肝臟細(xì)胞Chang Liver,以Dasatinib作用細(xì)胞不同時(shí)間,檢測細(xì)胞活性氧簇(ROS)的變化情況。(2)采用大鼠原代肝臟細(xì)胞和永生化的人肝臟細(xì)胞Chang Liver,作用Dasatinib不同時(shí)間,Western Blot法檢測MAPK通路中JNK、ERK、p38及其磷酸化水平的變化。(3)運(yùn)用小分子RNA干擾技術(shù),沉默大鼠原代肝臟細(xì)胞中MAPK通路蛋白JNK、ERK的表達(dá),給予Dasatinib處理后24h,PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化,Western Blot法檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、c-caspase-3的表達(dá)情況。(4)運(yùn)用小分子RNA干擾技術(shù),沉默大鼠原代肝臟細(xì)胞和Chang Liver中MAPK通路蛋白p38的表達(dá),給予不同濃度的Dasatinib作用24h后,PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化,Western Blot法檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、 c-caspase-3的表達(dá)情況。(5)采用AO染色、MDC染色法,檢測p38激動(dòng)劑異丙腎上腺素(ISO)與Dasatinib合用后大鼠原代肝臟細(xì)胞自噬的變化情況。(6)采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測鹽酸異丙腎上腺素(ISO)對(duì)Dasatinib誘導(dǎo)的大鼠原代肝臟細(xì)胞和Chang Liver細(xì)胞凋亡的影響。(7)采用Western Blot法檢測ISO對(duì)Dasatinib引起的大鼠原代肝臟細(xì)胞和Chang Liver細(xì)胞自噬和凋亡蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、c-PARP、c-caspase-3及p-p38變化的影響。 采用ICR小鼠研究鹽酸異丙腎上腺素(ISO)在體內(nèi)對(duì)Dasatinib肝臟毒性的保護(hù)作用；同時(shí)采用人非小細(xì)胞肺癌A549、前列腺癌PC3、乳腺癌MDA-MB-231、和A549裸小鼠移植瘤模型,研究ISO對(duì)Dasatinib抗腫瘤作用的影響。(1)采用ICR小鼠,灌胃給以Dasatinib和腹腔注射ISO聯(lián)合給藥30天,觀察小鼠體重、血液生化指標(biāo)的變化,HE染色觀察肝臟組織損傷,研究ISO在體內(nèi)對(duì)Dasatinib肝臟毒性的影響。采用Western Blot法檢測小鼠肝臟中ISO對(duì)Dasatinib引起的凋亡蛋白c-PARP及c-caspase-3變化的影響。(2)采用Western Blot法檢測小鼠肝臟中ISO對(duì)Dasatinib引起的自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ及p-p38變化的影響。(3)采用TEM觀察ISO在體內(nèi)對(duì)Dasatinib引起自噬的影響。(4)選取A549、PC3、MDA-MB-231三株腫瘤細(xì)胞,給予保護(hù)濃度的ISO和Dasatinib作用細(xì)胞24h,PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測ISO在體外對(duì)Dasatinib抗腫瘤作用的影響。(5)采用A549非小細(xì)胞肺癌裸小鼠移植瘤模型,灌胃給以Dasatinib和腹腔注射ISO聯(lián)合給藥30天,通過檢測瘤重、瘤體積、相對(duì)腫瘤體積,觀察ISO在體內(nèi)對(duì)Dasatinib抗腫瘤作用的影響。 結(jié)果： 1) Dasatinib在臨床治療劑量下誘導(dǎo)肝臟毒性的同時(shí)可以激活自噬,抑制自噬可以增強(qiáng)Dasatinib引起的肝臟毒性 Dasatinib25mg/kg灌胃給藥ICR小鼠30天后,與臨床報(bào)道一致的引起肝臟功能紊亂。Dasatinib50mg/kg灌胃給藥A549移植瘤裸小鼠30天后,與對(duì)照組相比,Dasatinib給藥組明顯抑制腫瘤生長,抑瘤率為55.9%,但Dasatinib給藥組的小鼠體重明顯下降,同時(shí),血清中的肝酶ALT、AST、LDH含量是對(duì)照組的2-3倍,肝臟切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dasatinib引起多個(gè)區(qū)域的炎性反應(yīng),表明Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤活性的同時(shí)有明顯的肝臟毒性。采用組織電鏡檢測到Dasatinib組裸小鼠肝臟組織自噬泡的存在,Western Blot結(jié)果顯示Dasatinib組裸小鼠肝臟組織自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換明顯增加。另外,ICR小鼠給予Dasatinib30天,給藥期間給藥組與對(duì)照組小鼠平均攝食量沒有變化；給予營養(yǎng)劑和Dasatinib組的小鼠肝臟組織與未給予營養(yǎng)劑相比,仍有相同程度的LC3Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)換和血清生化指標(biāo)的升高,HE染色觀察肝臟組織發(fā)現(xiàn)給予營養(yǎng)劑并不能逆轉(zhuǎn)Dasatinib誘導(dǎo)的肝組織損傷,表明肝臟中自噬的激活是Dasatinib誘導(dǎo)的,而不是營養(yǎng)缺乏所致。采用AO和MDC染色法檢測大鼠原代肝臟細(xì)胞內(nèi)自噬泡的產(chǎn)生和分布情況,結(jié)果表明,隨著Dasatinib作用時(shí)間和作用濃度的增加,標(biāo)記酸性囊泡的紅色熒光和示蹤自噬泡的點(diǎn)狀熒光均逐漸增加,呈濃度和時(shí)間依賴性。Western Blot確證了自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換以及自噬底物蛋白p62的大量降解,表明Dasatinib在給藥后的組織和細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。體內(nèi)ICR小鼠不同時(shí)間的血清及肝臟組織結(jié)果顯示,Dasatinib肝臟毒性出現(xiàn)在給藥第三周,而自噬出現(xiàn)在給藥第四周。體外肝細(xì)胞中2mM的3-MA與12.5μM的Dasatinib共同作用24h,與Dasatinib單用組相比有明顯的細(xì)胞凋亡率,同時(shí)伴隨著凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3的明顯增加。沉默大鼠原代肝細(xì)胞中ATG-5表達(dá)可以增加Dasatinib凋亡率和凋亡蛋白的表達(dá)；體內(nèi)ICR小鼠給予2mg/kg的3-MA和50mg/kg的Dasatinib組給藥30天后體重明顯低于Dasatinib單用組,同時(shí)有2只(n=6)小鼠死亡(其他各組無死亡),合用組血液生化指標(biāo)ALT、AST、LDH明顯高于Dasatinib單用組,并且肝臟組織切片HE染色顯示出更強(qiáng)的損傷,說明抑制自噬可以增強(qiáng)Dasatinib的肝臟毒性。 2) Dasatinib引起的自噬是由p38-MAPK所介導(dǎo)的,小分子p38激動(dòng)劑鹽酸異丙腎上腺素(ISO)可以通過激活p38介導(dǎo)的自噬保護(hù)Dasatinib的肝臟毒性。 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS顯示在Dasatinib作用0-7h的過程中,細(xì)胞中的ROS含量逐漸增高,并于7h達(dá)到最大。Western Blot結(jié)果顯示,Dasatinib作用后細(xì)胞中JNK、ERK、p38的磷酸化水平增強(qiáng)。用小分子RNA干擾技術(shù)將MAPK通路JNK、 ERK沉默后,發(fā)現(xiàn)Dasatinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3明顯減少,但對(duì)自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例沒有影響。用小分子RNA干擾技術(shù)將MAPK通路p38沉默后,發(fā)現(xiàn)隨著Dasatinib給藥濃度的增加,其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3逐漸增加,同時(shí)自噬關(guān)鍵蛋白LC3II/I的比例逐漸降低。AO、MDC染色結(jié)果顯示,10nM的ISO可以明顯增加Dasatinib引起的酸性囊泡。PI流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,原代肝細(xì)胞的凋亡率由Dasatinib單用組的48.0%減少到了ISO與Dasatinib合用組的26.0%；Chang liver細(xì)胞的凋亡率由單用組46.0%的減少到了合用組的26.0%。同時(shí),Western Blot結(jié)果顯示,合用組ISO的自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例明顯增加,而凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3明顯減少。這說明ISO在體外肝臟細(xì)胞中可以通過激活p38介導(dǎo)的自噬,保護(hù)Dasatinib的肝臟毒性。 3)ISO可以在體內(nèi)明顯保護(hù)Dasatinib誘導(dǎo)的肝臟毒性,同時(shí)在體內(nèi)外不影響Dasatinib的抗腫瘤活性 體內(nèi)ICR小鼠結(jié)果顯示,ISO8ng/kg與Dasatinib50mg/kg合用組可以明顯回調(diào)Dasatinib50mg/kg單用組引起的小鼠體重減輕,同時(shí)也降低Dasatinib累積的血清ALT、AST和LDH的升高；HE染色結(jié)果顯示ISO可以明顯減輕Dasatinib引起的小葉中心壞死、彌漫性肝變性和慢性多灶點(diǎn)炎癥。同時(shí),Western Blot結(jié)果顯示,ISO在小鼠肝臟中可以明顯降低Dasatinib引起的凋亡蛋白c-PARP和c-caspase-3的表達(dá)。進(jìn)一步的,TEM和Western blot的結(jié)果確證了,ISO在小鼠肝臟細(xì)胞中可以明顯增強(qiáng)Dasatinib誘導(dǎo)的自噬。在體外三株腫瘤細(xì)胞A549、PC3、MDA-MB-231中,10nM的ISO與10μM的Dasatinib合用不會(huì)降低Dasatinib的抗腫瘤活性。同時(shí)在體內(nèi)A549裸小鼠移植瘤模型中,8ng/kg的ISO不影響50mg/kg的Dasatinib的抗腫瘤作用。說明ISO在保護(hù)Dasatinib引起的肝臟毒性的同時(shí),不會(huì)影響其抗腫瘤效果。 結(jié)論： 本課題揭示了Dasatinib在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)具有明顯的肝臟損傷,而通過p38介導(dǎo)的保護(hù)性自噬可以對(duì)抗Dasatinib誘導(dǎo)的肝臟毒性,闡明了Dasatinib肝損傷的新機(jī)制。同時(shí),鹽酸異丙腎上腺素(ISO)可以在不影響Dasatinib抗腫瘤作用的同時(shí)明顯改善Dasatinib誘導(dǎo)的肝臟功能下降,為臨床Dasatinib的廣泛應(yīng)用及其肝臟毒性的防治提供了新穎的、可行的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1916073