本文選題：人胚胎干細胞 + TALEN　； 參考：《吉林大學》2014年博士論文

【摘要】：人肝細胞作為檢測藥物吸收、分布、代謝、排泄及毒性的體外實驗金標準模型之一，被廣泛應用于臨床前藥物研究。CYP3A亞家族是細胞色素P450酶系家族中最為重要的成員，它在肝CYP中含量最高，在肝細胞對于藥物代謝和解讀功能中承擔著50%的作用。 新鮮分離的人原代肝臟細胞是用于藥物研發(fā)以及生物人工肝的最理想細胞來源，但是由于肝臟供體的嚴重稀缺以及體外表型維持困難等特點，極大地限制了其應用；而其他的以細胞為基本單位成分的分析模型，，如其他動物來源的原代肝臟細胞，或人肝癌細胞系，其代謝酶類和表達譜皆不能真實地反應正常人肝細胞的生理表現，例如在一些肝癌細胞系中很多代謝酶的水平與人原代成體肝細胞呈指數級的差異；干細胞體外定向分化研究的進展，使來自于干細胞的肝細胞成為最接近正常人原代肝細胞來源成為可能，然而目前遇到的共性問題是這種在體外定向分化得到的肝細胞，往往在功能上不成熟，表現為參與藥物代謝的重要P450蛋白表達量低，不能表達成熟肝細胞特異表達的轉錄因子或蛋白質；或者這種具備條件的成熟數量極少，很難區(qū)分，因此也很難大規(guī)模應用。目前尚缺乏能在體外識別信號通路的調節(jié)和代謝功能的可靠工具。 本研究首次報道了利用TALEN技術構建了打靶的人胚胎干細胞系，在體外直接分化成為具有功能性的肝細胞；這一被標記的干細胞分化體系可以識別能夠促進CYP3A4表達的候選者�；赥ALEN打靶技術，我們將增強型綠色熒光蛋白eGFP的基因片段插入到CYP3A4基因的外顯子區(qū)域，使得eGFP能夠有效的被CYP3A4的啟動子調控。這一敲入CYP3A4:eGFP的細胞系在體外被定向誘導分化為人肝細胞，利用GFP作為CYP3A4的報告基因，沿用前人報道的體外定向誘導分化的方法，驗證了這一基因報告細胞系具有和野生型人胚胎干細胞系同樣的分化潛能；同時，這個基因標記的人胚胎干細胞系能夠正確反映在細胞分化過程中CYP3A4基因的實際表達情況，可以作為篩選影響肝臟細胞成熟過程中關鍵因子的體系。 然后，利用這一被標記的干細胞分化體系，我們在肝臟細胞發(fā)育的前體階段加入了不同的細胞因子，以期篩選出促進功能性肝細胞分化的因子。研究表明表皮生長因子EGF可以作為一個信號蛋白有效地促進和維持人肝細胞在體外CYP3A4的表達。相對于傳統(tǒng)的分化體系，添加了EGF的分化體系使得在體外分化的人肝細胞從5.9%增加到40.2%。隨后，我們將分化得到的肝細胞移植到肝損傷小鼠URG（Tet-uPA/Rag2-/-/Il2rg-/-）體內，2周后在小鼠的血清中即檢測到了人白蛋白的表達，證明分化的細胞具有移植重建肝臟的能力。 本研究從實用的角度出發(fā)，建立了一種便于操作，直觀觀察即能評價體外分化的肝臟細胞成熟情況的有效篩選體系；以此為基礎，可以對現有的分化體系進行培養(yǎng)條件、誘導時間等方面的優(yōu)化，以提高分化效率。同時，通過該體系的應用，我們發(fā)現EGF作為一個新的調節(jié)蛋白在CYP3A4基因表達中起到了至關重要的作用。更為重要的是，用此評價體系得到的肝臟細胞具有和人成體肝臟細胞相類似的蛋白表達和mRNA轉錄水平，用該體系評價出來的細胞極有可能成為藥物開發(fā)中檢測肝臟毒性、藥物相互作用評估的工具。基于TALEN技術的基因打靶，與人胚胎干細胞向肝細胞定向分化體系的結合，可以成為在體外獲得穩(wěn)定代謝功能的人肝細胞的可靠篩選模型，從而為以后提供供體細胞、建立人源化動物模型在體研究和應用分化的干細胞進行體外藥物篩選都具有著十分重要的意義。
[Abstract]:Human hepatocytes are one of the gold standard models for the detection of drug absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity in vitro. The.CYP3A subfamily is the most important member of the cytochrome P450 enzyme family, which is the most important member of the cytochrome CYP family. It has the highest content in the liver CYP, and is responsible for the metabolism and interpretation of the liver cells in the liver cells. The role of 0%.
Fresh isolated human primary liver cells are the most ideal source of cell for drug development and bioartificial liver. However, due to the severe scarcity of the liver donor and the difficulty of maintaining the phenotypes in vitro, its application is greatly limited; other analytical models, such as other animal sources, are the basic units of cells. The metabolic enzymes and expression profiles of the liver cells, or human hepatoma cells, can not truly reflect the physiological performance of normal human hepatocytes. For example, many metabolic enzymes in some liver cancer cells are at an exponential level with those of human primary hepatocytes; the progress in the study of stem cell differentiation in vitro is derived from stem cells. Hepatocyte becomes the closest source of primary hepatocyte origin to normal people. However, the common problem is that the liver cells that have been differentiated in vitro are often immature in function, showing the low expression of important P450 proteins involved in drug metabolism, and can not reach a transcriptional factor or protein expressed by the mature hepatocytes. It is difficult to discriminate, and therefore difficult to be used in large-scale applications. There is still a lack of reliable tools to identify the regulatory and metabolic functions of the signaling pathways in vitro.
This study is the first to report the use of TALEN technology to build a target human embryonic stem cell line, which is directly differentiated into functional liver cells in vitro; this labeled stem cell differentiation system can identify candidates for the promotion of CYP3A4 expression. Based on TALEN targeting, we will enhance the gene for enhanced green fluorescent protein eGFP The fragment was inserted into the exons of the CYP3A4 gene so that eGFP could be effectively regulated by the promoter of the CYP3A4. The cell line that entered CYP3A4:eGFP was directed to differentiate into human hepatocytes in vitro, and GFP was used as a reporter gene for CYP3A4. The gene report was used to verify the gene report. The cell line has the same differentiation potential as the wild human embryonic stem cell line. At the same time, the human embryonic stem cell line marked by this gene can correctly reflect the actual expression of CYP3A4 gene in the process of cell differentiation, and can be used as a system to screen the key factors in the process of liver cell maturation.
Then, using this labeled stem cell differentiation system, we added different cytokines to the precursors of the liver cell development in order to screen out factors that promote functional hepatocyte differentiation. The study shows that epidermal growth factor EGF can effectively promote and maintain human hepatocytes in CYP3A4 as a signal protein. Compared with the traditional differentiation system, the differentiation system of EGF was added to increase the differentiation of human hepatocytes from 5.9% to 40.2%., and the differentiated hepatocytes were transplanted into the liver injury mice URG (Tet-uPA/Rag2-/-/Il2rg-/-). After 2 weeks, the expression of human albumin was detected in the blood albumin of the mice. The transformed cells have the ability to transplant and reconstruct the liver.
From a practical point of view, this research establishes an effective screening system which is convenient for operation and intuitionistic observation that can evaluate the maturation of liver cells differentiated in vitro. Based on this, we can optimize the existing differentiation system and induce time to improve the differentiation efficiency. At the same time, through the application of the system, We found that EGF plays a vital role in the expression of CYP3A4 gene as a new regulatory protein. More importantly, the liver cells obtained by this evaluation system have a similar protein expression and mRNA transcriptional level with human adult liver cells, and the cells evaluated with this system are extremely likely to become drug development. A tool for the detection of liver toxicity and drug interaction. Based on the gene targeting of TALEN technology and the combination of human embryonic stem cells to the directional differentiation system of liver cells, it can be a reliable screening model for human liver cells with stable metabolism in vitro, thus providing donor cells and establishing a humanized animal model for the future. Research and differentiation of stem cells in vitro drug screening are of great significance.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R96

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本文編號：1903690