本文選題：肺炎鏈球菌 + 催化ATP酶結(jié)構(gòu)域�。� 參考：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:本課題組前期采用分子對(duì)接的方法,篩選出以肺炎鏈球菌Wal K酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的咪唑類化合物6,其在體外展示出較好的抗菌活性,但其體內(nèi)保護(hù)效果不理想,且細(xì)胞毒性較高。本研究擬以肺炎鏈球菌Wal K酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域(CA結(jié)構(gòu)域)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸功能殘基為藥物作用靶點(diǎn),采用化合物6為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板,設(shè)計(jì)并合成一系列新型咪唑類抗菌化合物。通過(guò)化合物和三種不同的Wal K蛋白相互作用,驗(yàn)證新型化合物抗菌靶點(diǎn)位于肺炎鏈球菌Wal K酶CA結(jié)構(gòu)域;通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)考查化合物抗菌活性及毒性反應(yīng);通過(guò)建立小鼠肺炎鏈球菌感染模型,檢測(cè)其體內(nèi)抗菌效應(yīng)。本研究擬最終獲得毒性小、體內(nèi)抗菌活性高、可能具有廣譜抗革蘭陽(yáng)性菌的新型抗菌藥物。方法:本課題擬通過(guò)分子設(shè)計(jì)—合成—生物活性測(cè)試模式,采用活性基團(tuán)拼接法和取代法,合成一系列新型咪唑類抗菌藥物;再對(duì)合成的咪唑類抗菌藥物進(jìn)行元素、1H NMR、13C NMR、MS(ESI)、熔點(diǎn)、遠(yuǎn)紅外光譜等表征分析。利用PCR法擴(kuò)增3種不同肺炎鏈球菌Wal K基因序列(全長(zhǎng)、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域),并構(gòu)建3種Wal K基因序列的重組pp SUMO質(zhì)粒,再將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,依靠IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及Ni-NTA親和層析,得到純度較高的可溶性目的蛋白;利用該蛋白免疫BALB/C小鼠獲取多克隆抗體,經(jīng)ELISA法檢測(cè)其特異性Ig G抗體效價(jià),經(jīng)Western Blot鑒定Wal K全長(zhǎng)蛋白在4種S.pn血清型菌株中的保守性。利用ATP激酶發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)以上三種蛋白的激酶活性,檢測(cè)蛋白與新型咪唑類化合物作用后的激酶活性變化(IC50)。通過(guò)最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物的體外抗菌效應(yīng)以及細(xì)胞毒性作用。構(gòu)建BALB/C小鼠的腹腔S.pn感染模型,通過(guò)尾靜脈注射途徑給藥,觀察小鼠的生存時(shí)間和生存率。結(jié)果:本課題組前期已經(jīng)成功合成以原始化合物6為母體的15種新型咪唑類化合物,并對(duì)其中的6種化合物進(jìn)行了1H NMR、13C NMR、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜、熔點(diǎn)等結(jié)構(gòu)和組成表征分析,結(jié)果提示為預(yù)期目標(biāo)分子。成功構(gòu)建和表達(dá)Wal K(全長(zhǎng)、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域)重組蛋白;以全長(zhǎng)Wal K蛋白免疫小鼠后獲得高滴度的多克隆抗體,Western Blot分析證實(shí),CMCC(B)31207、CMCC(B)31203、CMCC(B)31693、NTCC7466(D39)等4種S.pn菌株均能穩(wěn)定的表達(dá)Wal K全長(zhǎng)蛋白。隨著新型咪唑類化合物(2號(hào)、4號(hào)及5號(hào))藥物濃度的逐漸增高,Wal K全長(zhǎng)組和僅含有CA結(jié)構(gòu)域組ATP激酶活性均持續(xù)降低(均P0.05);而不同濃度的新型咪唑類化合物(2號(hào)、4號(hào)及5號(hào))與缺陷CA結(jié)構(gòu)域組作用,其ATP激酶活性變化無(wú)明顯差異(P0.05)。通過(guò)最小抑菌濃度、最小殺菌濃度等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),新合成咪唑類化合物2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)均具有較好的抑菌及殺菌效應(yīng),其中4號(hào)化合物抑菌及殺菌效果最為明顯(P0.01);細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí),三種化合物細(xì)胞毒性均顯著低于原始化合物(P0.01),其中以2號(hào)細(xì)胞毒性最低(1170μM)�；衔飳�(duì)腹腔感染D39型肺炎鏈球菌小鼠的治療效果證實(shí),與陽(yáng)性對(duì)照組(PNC組)比較,原始化合物6號(hào)、新合成咪唑類化合物4號(hào)、5號(hào)的保護(hù)效果均未見明顯差異(均P0.05);2號(hào)化合物與陽(yáng)性對(duì)照組間比較其保護(hù)效果明顯降低(P0.05)。結(jié)論:Wal K全長(zhǎng)重組蛋白在不同血清型S.pn中保守性較好,新合成咪唑類化合物(2號(hào)、4號(hào)及5號(hào))具有抑制Wal K酶CA結(jié)構(gòu)域ATP激酶活性的效應(yīng);最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗(yàn)均證實(shí)4號(hào)化合物在體外具有極佳的抗菌及殺菌效應(yīng);細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)以2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)化合物細(xì)胞毒性均顯著低于原始化合物;體內(nèi)抗菌效應(yīng)試驗(yàn)提示新合成的咪唑類化合物4號(hào)、5號(hào)均能夠明顯延長(zhǎng)腹腔感染肺炎鏈球菌D39小鼠的生存時(shí)間。本研究首次證實(shí)新合成的4號(hào)咪唑類化合物可能是未來(lái)治療肺炎鏈球菌感染的新型藥物,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將著重其藥物代謝學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)方面的深入研究,以期篩選出抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染的廣譜新型咪唑類化合物。
[Abstract]:Objective: to select the imidazole compound 6, which is the target of the Wal K enzyme HATPase-c domain of Streptococcus pneumoniae, in the early stage of this study, it shows good antibacterial activity in vitro, but its protective effect is not ideal in vivo, and the cytotoxicity is high. This study is to use the Wal K enzyme HATPase-c domain of Streptococcus pneumoniae. A series of novel imidazole antibacterial compounds were designed and synthesized by using compound 6 as the precursor template in the three-dimensional structure of the CA domain. A series of new imidazole antibacterial compounds were designed and synthesized by using compound 6 as the leading structure template. Through the interaction of compounds and three different Wal K proteins, the anti bacteria target of the new compound was located in the Wal K enzyme domain of Streptococcus pneumoniae; Test the antibacterial activity and toxic reaction of the compound in vitro; by establishing the model of Streptococcus pneumoniae infection in mice, to detect the antibacterial effect in vivo. This study is intended to eventually obtain small toxicity, high antibacterial activity in the body, and may have a new type of antibacterial agent with broad spectrum anti gram positive bacteria. A series of new imidazole antibacterials were synthesized by active group splicing and substitution method, and then the synthetic imidazole antibacterials were characterized by elemental, 1H NMR, 13C NMR, MS (ESI), melting point and far infrared spectroscopy. The PCR method was used to amplify the Wal K sequence of 3 different Streptococcus pneumoniae (total length, defect CA structure). The domain, which only contains the CA domain), and constructs the recombinant PP SUMO plasmid of 3 Wal K gene sequences, then transforms it into E.coli BL21, and obtains the high purity soluble target protein by IPTG induced expression and Ni-NTA affinity chromatography. The polyclonal antibody is obtained by using the protein to immunize BALB/C mice and the specific Ig antibody titer of its specific Ig is detected by ELISA method. The conservatism of Wal K full-length protein in 4 S.pn serotype strains was identified by Western Blot. The kinase activity of the above three proteins was detected by the ATP kinase luminescence detection kit, and the activity of kinase activity (IC50) after the action of the protein and new imidazole compounds was detected. The minimum bacteriostasis concentration (MIC), the minimum bactericidal concentration (MBC) and cytotoxicity were obtained. The in vitro antibacterial effect and cytotoxicity of the compound were evaluated by the experiment of sex test (MTT method). The S.pn infection model of the abdominal cavity of BALB/C mice was constructed. The survival time and survival rate of the mice were observed through the injection of the tail vein. Results: the group had successfully combined the 15 new imidazole groups of the original compound 6 in the early stage. Compounds were used to analyze the structure and composition of the 6 compounds, such as 1H NMR, 13C NMR, high resolution mass spectrometry, infrared spectrum, melting point and so on. The results suggested that the target molecule was expected. The recombinant protein was successfully constructed and expressed in Wal K (full length, defective CA domain, only CA domain), and the high titer was obtained after the whole long Wal K protein was immune to mice. The Western Blot analysis showed that the 4 S.pn strains of CMCC (B) 31207, CMCC (B) 31203, CMCC (B) 31693, NTCC7466 (D39), and so on were all stable to express Wal full length protein. P0.05, while the different concentrations of the new imidazole compounds (No. 2, No. 4 and 5) and the defective CA domain group have no significant difference in the activity of ATP kinase (P0.05). Through the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration in vitro, the new synthetic imidazole compound 2, 4 and 5 have better bacteriostasis and bactericidal effect, The bacteriostasis and bactericidal effect of compound 4 was most obvious (P0.01). Cytotoxicity test confirmed that the cytotoxicity of the three compounds was significantly lower than that of the original compound (P0.01), and the cytotoxicity of No. 2 was the lowest (1170 mu M). The therapeutic effect of the compound on the peritoneal infection of Streptococcus pneumoniae mice was confirmed, compared with the positive control group (PNC group). Compound 6, new synthetic imidazole compound No. 4, No. 5, no significant difference in protection (all P0.05), the protective effect of compound 2 was significantly lower than that between positive control groups (P0.05). Conclusion: Wal K full length recombinant protein is conserved in different serotype S.pn, and new synthetic imidazole compounds (No. 2, 4 and 5) have inhibitory effect. The effect of Wal K enzyme CA domain ATP kinase activity was made. The minimum bacteriostasis concentration and minimum bactericidal concentration test showed that compound 4 had excellent antibacterial and bactericidal effect in vitro. Cytotoxicity test showed that the cytotoxicity of compound 2, No. 4 and No. 5 was significantly lower than that of the original compound; in vivo antibacterial effect test suggested the newly synthesized mica. The number of azoles 4 and 5 can significantly prolong the survival time of the abdominal infection of Streptococcus pneumoniae D39 mice. This study is the first to confirm that the newly synthesized 4 imidazole compounds may be a new drug for the treatment of Streptococcus pneumoniae infection in the future. A broad spectrum of new imidazole compounds resistant to gram positive bacterial infections.

【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：1882409