本文選題：重編程　切入點：誘導多能干細胞　出處：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:誘導多能干細胞是通過導入特定的基因或基因產(chǎn)物,將已分化的體細胞人工誘導重編程成為類似于胚胎干細胞(embryonicstemcell,ES)的、具有多向分化能力的、可以持續(xù)分離生長的多功能干細胞。這項技術由日本京都大學Yamanaka教授在2006年首先提出。人工誘導多能干細胞通過取自體體細胞進行體外培養(yǎng),這就同時避免了ES產(chǎn)生的倫理和排異兩大障礙。目前傳統(tǒng)的iPSCs技術主要是通過逆轉錄病毒介導的轉基因技術將4個細胞因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc(即OSKM)導入宿主細胞中而獲得iPSCs細胞。通過OSKM因子使得終末分化的體細胞重編程后成為iPSCs的效率非常低,只有大約0.05%。這種低效率對于人iPSCs應用造成了巨大的障礙。因此,人們?yōu)榱烁淖冞@一低效的重編程過程做出了大量的努力,通過應用DNA甲基化抑制劑,組蛋白修飾酶抑制劑,抑制腫瘤抑制基因,維生素C,信號通路抑制劑等來提高效率。小分子化學劑丙戊酸(valproicacid,VPA)是一種組蛋白去乙�；敢种苿Ｔ谂R床上,丙戊酸鈉被用于治療癲癇、雙向性躁狂,預防偏頭痛。在應用決定性因子OSKM使體細胞重編程成為iPSCs的過程中加入VPA已被證實對重編程效率有促進作用。然而目前對于VPA如何提高重編程的誘導作用的分子機制知之甚少。為了探討VPA在iPSCs重編程中的作用和機制,我們進行以下實驗。方法:1.首先將人骨髓來源的體細胞通過慢病毒轉導入OSKM因子,然后轉移至鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblast,MEF)飼養(yǎng)層細胞上,之后根據(jù)是否添加VPA,將其分成兩個組。通過堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AP)染色驗證形成的的細胞克隆是否具有干性,并比較兩個組之間的細胞克隆的形成的差異,進一步通過免疫組織化學染色,證明形成的iPSCs樣集落是否具有多向分化潛能。接著我們通過形態(tài)觀察及衰老相關β半乳糖苷酶(senescence-associatedbeta-galactosidase,SA-β-gal)染色,比較兩組細胞在iPSCs重編程的過程中細胞增殖及衰老的情況,并提出假設,VPA是否通過抑制重編程導致的衰老來達到提高誘導多能干細胞的效率。2.由于使用OSKM慢病毒感染細胞重編程是效率極低的耗時過程,最關鍵的是MEF飼養(yǎng)層細胞的存在可能妨礙后續(xù)的機理研究。對于這一點,我們通過一個簡單的銅誘導早衰模型取代OSKM慢病毒感染模型來研究VPA的作用。我們通過噻唑藍(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)染色法,測定不同銅濃度下細胞的存活率,來探究最適宜的銅濃度,以求得到最佳的化學誘導早衰模型。3.之后我們通過銅誘導早衰模型從細胞水平及分子水平研究VPA對于衰老的影響。通過細胞形態(tài)觀察及及SA-β-gal染色,探究VPA對化學誘導的早衰的保護作用。通過磺酰羅丹明B(SulforhohamineB,SRB)染色法檢測細胞的增殖,研究VPA在改善細胞生長中的作用。通過RT-PCR和Western印跡法,檢測衰老相關基因的表達水平,以探究VPA在凋亡通路中的作用。最后通過檢測細胞周期,研究VPA在細胞阻滯中發(fā)揮的作用。結果:1.在OSKM慢病毒感染模型中OSKM單獨處理組與OSKM+VPA處理組比較,兩組都出現(xiàn)細胞克隆,并且后者AP染色陽性的iPSCs集落明顯多于前者,差異有顯著性(P0.01)。免疫組織化學染色表明,iPSCs集落其多向分化潛能標志物如SSEA-4和Tra1-60是陽性的,證明獲得的細胞克隆具有干性及多向分化的潛力。OSKM單獨處理組與OSKM+VPA處理組比較,前者細胞的形態(tài)具有明顯衰老的特征,同時細胞的增殖明顯比后者緩慢。經(jīng)過SA-β-gal染色,前者染色陽性的細胞明顯多于后者。2.在銅誘導的早衰模型中,用不同劑量的硫酸銅處理細胞,細胞存活率不同。當硫酸銅的濃度增加時,細胞存活率相應降低。當細胞暴露于較低濃度硫酸銅時,存活率略有下降,而一旦超過某一濃度,細胞存活率明顯下降。通過MTT法,我們最終選擇500,600和625μM硫酸銅濃度分別作為HSC-L1,HSC-2和MDFs銅誘導的早衰模型的最佳濃度。3.在銅誘導的早衰模型中,我們將細胞分為4組:陰性對照組、VPA單獨處理組、硫酸銅處理組、硫酸銅+VPA處理組。VPA單獨處理組與陰性對照組相比,細胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化。硫酸銅處理組與陰性對照組相比,細胞數(shù)量降低,細胞形態(tài)明顯衰老,SA-β-gal染色陽性細胞比例明顯升高。硫酸銅+VPA處理組與硫酸銅單獨處理組相比,細胞生長明顯改善,衰老細胞比例明顯降低。SRB法測量細胞增殖,將對照組細胞的數(shù)量作為100%,可見硫酸銅處理組較對照組細胞增殖明顯降低(P0.05),硫酸銅+VPA處理組細胞增殖較硫酸銅處理組明顯升高(P0.01)。通過RT-PCR及Western印跡法,從RNA及蛋白質水平檢測凋亡基因。將β-ACTIN作為內參,硫酸銅處理組與陰性對照組相比,促凋亡基因p16,p21,小窩蛋白(caveolin-1,Cav-1),載脂蛋白J(apolipoproteinJ,APO-J),食欲素受體1(orexinreceptors1,OX-1)表達明顯增強,抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2(B-celllymphoma2,Bcl-2)明顯降低。硫酸銅+VPA處理組與硫酸銅處理組比較,促凋亡基因有所下降,抗凋亡基因有所上升。通過流式細胞術檢測細胞周期。對照組G2/M期比例為14.2%,硫酸銅處理組G2/M期比例為61.2%,明顯較對照組高。硫酸銅+VPA處理組G2/M期比例為44%,較硫酸銅組明顯降低。對照組與硫酸銅組,硫酸銅組與硫酸銅+VPA處理組比較,G2/M期比例有顯著差異(P0.01)。結論:1.通過慢病毒介導的轉基因技術將4個細胞因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc(即OSKM)導入人骨髓來源細胞可以獲得細胞克隆。經(jīng)過AP染色以及SSEA-4和Tra1-60免疫組織化學染色,證明獲得的細胞克隆具有干性及多向分化的潛力,是iPSCs細胞。在重編程的過程中出現(xiàn)細胞衰老,細胞增殖減慢等現(xiàn)象,補充VPA后細胞衰老比例下降,增殖速率提高,iPSCs集落明顯增加,說明VPA通過保護細胞免受重編程觸發(fā)的衰老來促進iPSCs集落的產(chǎn)生。2.OSKM慢病毒感染細胞與用亞細胞毒性濃度的銅處理細胞都會出現(xiàn)細胞增殖受抑,細胞體積增大,衰老相關β-半乳糖苷酶活性升高等衰老相關特征,故銅誘導的早衰模型可以代替OSKM慢病毒感染模型。經(jīng)MTT檢測,500,600和625μM硫酸銅濃度分別為HSC-L1,HSC-2和MDFs造衰老模型的最佳濃度。3.在銅誘導的早衰模型中,丙戊酸可以通過抑制促凋亡基因表達,促進抗凋亡基因表達,降低細胞周期阻滯來抑制細胞的衰老,促進細胞增殖。進而證明丙戊酸通過以上途徑保護細胞免受重編程觸發(fā)的衰老來促進iPSCs集落的產(chǎn)生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R96

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本文編號：1706595