本文選題：誘導表位　切入點：印跡　出處：《西南大學》2017年碩士論文

【摘要】：近年來,選擇合適的配體如多肽、抗體、核酸適配體等修飾于遞藥系統(tǒng),用于特異性的識別腫瘤細胞膜表面特定的受體并與之結合,是實現(xiàn)腫瘤靶向的重要策略之一。分子印跡技術是以制備分子印跡聚合物為目標,選擇合適的模板分子,人工合成具有特異性分子識別功能物質的一種技術。分子印跡聚合物與其模板重結合的過程類似于拿“鑰匙”開“鎖”的過程,與天然抗體相比,分子印跡聚合物作為“人工抗體”具有制備可控性強、理化性質穩(wěn)定、抗干擾能力強等優(yōu)點,并且具有一定三維空間結構的模板印跡聚合物與模板分子進行特異性結合的能力遠遠強于一級結構的模板印跡聚合物。本課題組前期將分子印跡技術與多肽設計相結合,提出以具有二級結構的多肽作為模板分子的構象表位印跡策略,并將其用于腫瘤靶向藥物遞送。其選取p32蛋白末端關鍵氨基酸序列嫁接于蜂毒明肽apamin,設計合成α螺旋構型的多肽并將其作為模板分子制備印跡納米粒,用于p32蛋白高表達的腫瘤靶向藥物遞送。然而,p32蛋白末端為特殊的α螺旋結構,生物體內(nèi)大部分膜蛋白的末端沒有特定的二級結構,使得這一策略有了局限性。那么對于大部分末端無固定二級結構的膜蛋白,我們可否將其末端誘導為一定的二級結構,以期其與印跡納米粒發(fā)生較強的特異性結合呢?基于此,本論文特提出誘導表位印跡策略,即選擇合適的誘導劑將線性肽誘導為α螺旋結構,并以“α螺旋化”的多肽作為模板合成分子印跡納米粒,該納米�？蓪⑵湎鄳哪さ鞍啄┒苏T導趨向于α螺旋,并發(fā)生較強的特異性結合作用。以葉酸受體(Folate receptor,FR)為模型,多種腫瘤細胞表面高表達葉酸受體,常將其作為靶點用于腫瘤靶向藥物遞送,而葉酸受體蛋白N端多肽鏈(FN)為無規(guī)則線性結構,選擇合適的誘導劑將FN肽誘導為α螺旋,以“α螺旋化”的FN肽為模板分子,合成分子印跡納米粒(MIPNP-F),特異性的識別并誘導細胞膜表面FR末端多肽鏈的二級結構趨向于α螺旋,并進行特異性結合,從而實現(xiàn)腫瘤靶向。更值得關注的是,葉酸(Folic acid,FA)與FR的結合口袋遠離FR末端,可有效避免游離葉酸對MIPNP-F的靶向效果產(chǎn)生競爭性抑制。本論文第一部分對誘導表位印跡策略進行可行性分析。分別以apamin(α螺旋結構)及其線性衍生物linear apamin(apamin的4個半胱氨酸替換為丙氨酸)為模板分子,采用沉淀聚合法制備具有α螺旋“孔穴”的分子印跡納米粒(MIPNP-A)和具有無規(guī)則線性“孔穴”的分子印跡納米粒(MIPNP-L),探究MIPNP-A和MIPNP-L與apamin及l(fā)inear apamin間的相互作用發(fā)現(xiàn),MIPNP-A可將linear apamin誘導為α螺旋,并發(fā)生較強的特異性結合,而MIPNP-L對apamin的結合作用則較弱。該結果提示,具有α螺旋結構“孔穴”的印跡納米�？蓪⑵渚�性模板肽誘導為α螺旋并發(fā)生較強的特異性結合作用,反之,有線性“孔穴”的印跡納米粒對α螺旋的模板肽作用則較弱,初步表明在構象表位印跡基礎上提出的誘導表位印跡策略具備一定可行性。為進一步探索將誘導表位印跡策略用于腫瘤靶向藥物遞送,以FR高表達的腫瘤靶向為代表,選擇FR末端一段關鍵序列,設計合成FN肽,測定其二級結構,證明其本身為無規(guī)則線性結構,50%的三氟乙醇(2,2,2-Trifluoroethanol,TFE)可將其誘導為α螺旋。以丙烯酰胺和2-(三氟甲基)-丙烯酸為功能單體,以N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酸三氟乙酯為交聯(lián)劑,以FN肽為模板分子,在50%TFE溶劑中合成具有α螺旋“孔穴”的分子印跡納米粒(MIPNP-F),用動態(tài)光散射法測定其粒徑為(78.3±2.5)nm,多分散系數(shù)為(0.175±0.023),通過掃描電鏡和透射電鏡觀察顯示納米粒為分布均勻,外觀圓整的球形結構,提示MIPNP-F制備成功,為以MIPNP-F為載體用于葉酸受體高表達的腫瘤靶向藥物遞送奠定了基礎。第二部分主要對MIPNP-F進行體內(nèi)外功能評價和作為遞藥載體的安全性考察。多肽結構誘導和體外結合實驗顯示,MIPNP-F可將其線性模板肽的α螺旋比例由5%誘導為36%,并發(fā)生特異性結合。納米粒-細胞相互作用實時分析結果顯示,MIPMP-F與He La細胞作用有更高的信號響應值,KD值(2.81E-8±5.81E-10)也顯著低于非印跡納米粒(Non-imprinted polymer nanoparticles,NIPNP)與HeLa細胞作用的KD值(2.15E-5±3.05E-7)。用熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀測定MIPNP-F的細胞攝取情況發(fā)現(xiàn),在FR高表達的HeLa、KB和PANC-1細胞上,MIPNP-F的細胞攝取量分別為NIPNP的3.89倍、4.05倍和3.46倍,而在FR低表達的A549和MCF7細胞上,MIPNP-F和NIPNP的細胞攝取量沒有表現(xiàn)出明顯差別。探索MIPNP-F胞吞機制發(fā)現(xiàn),其入胞途徑與葉酸修飾的納米粒(FA-NP)基本一致,主要通過穴樣凹陷內(nèi)吞和大胞飲途徑內(nèi)吞,初步表明MIPNP-F可經(jīng)葉酸受體介導入胞。小動物活體成像檢測納米粒的體內(nèi)分布表明,MIPNP-F的腫瘤積累量明顯高于NIPNP。將光敏劑亞甲基藍包載于納米粒中,用光動力療法進行細胞藥效學評價發(fā)現(xiàn),在觀察期內(nèi)MIPNP-F組的IC50為2.12μg·mL-1,明顯低于NIPNP組IC50值3.96μg·mL-1;進行體內(nèi)藥效學考察發(fā)現(xiàn),MIPNP-F給藥組裸鼠皮下瘤大小基本維持不變,而NIPNP組腫瘤則呈增長趨勢。更值得關注的是,在細胞與游離葉酸孵育以及在裸鼠腫瘤附近給予高濃度葉酸預處理前提下,與FA-NP相反,葉酸對MIPNP-F的體內(nèi)外靶向效果沒有產(chǎn)生競爭性抑制。對印跡納米遞藥載體進行體內(nèi)外安全性評價,結果初步顯示,治療劑量的空白印跡聚合物納米粒對細胞和裸鼠機體沒有明顯毒性作用。以上細胞和動物實驗表現(xiàn)出MIPNP-F體內(nèi)外良好的靶向性,出色的藥效學性質及生物安全性,展現(xiàn)出將其作為遞藥載體用于腫瘤靶向光動力治療的巨大潛力。綜上所述,本文在構象表位印跡的基礎上,提出誘導表位印跡策略,并將其作為載體用于腫瘤靶向藥物遞送。在一定程度上解決了大部分膜蛋白質域結構靈活多變,難以靶向的問題;拓寬了受體識別的概念,為分子印跡技術的應用及腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)的設計提供了新的借鑒。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R943

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本文編號：1706480