本文選題：Foxo3a　切入點：DAC　出處：《華中科技大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分地西他濱對MDS細胞株SKM-1形分化、周期、凋亡影響及對Foxo3a和其下游相關分子表達影響 研究目的： 1、明確低濃度DAC處理不同時間對SKM-1細胞分化、周期和凋亡的影響； 2、明確SKM-1細胞中Foxo3a及p-Foxo3a在DAC處理不同時間后的改變； 3、明確DAC處理不同時間對SKM-1細胞周期和凋亡相關蛋白p21、p27、C-MYC、Bim和FasL表達的影響。 研究方法： l、流式細胞術檢測DAC處理不同時間后SKM-1細胞表面分子(CD14和CD11b)的動態(tài)變化； 2、流式細胞術檢測DAC處理不同時間后SKM-1細胞周期動態(tài)變化； 3、Hochest33342和Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測DAC處理0-6d后SKM-1凋亡改變； 4、Western Blot檢測DAC處理不同時間后SKM-1細胞中Foxo3a、p-Foxo3a、p21、 p27、C-MYC、Bim和FasL表達情況。 結果： 1、DAC處理后對SKM-1細胞中粒系分化標記物CD11b表達無顯著改變,但是可以增加單核細胞分化表面標記物CD14的表達； 2、DAC處理后SKM-1細胞中處于S期細胞比例降低,細胞阻滯于G0/G1和G2/M期； 3、DAC處理后,SKM-1細胞凋亡比例升高。DAC處理3d時早期和晚期凋亡細胞比例均升高,在第6d時,早期凋亡細胞升高幅度顯著高于晚期凋亡細胞； 4、雖然SKM-1細胞中有Foxo3a表達,但是處于失活狀態(tài)的p-Foxo3a水平較高,表明在SKM-1細胞中,Foxo3a處于失活狀態(tài)。DAC處理可以增加SKM-1細胞中Foxo3a的水平,并降低p-Foxo3a,使Foxo3a/p-Foxo3a比值升高,活化Foxo3a的轉錄活性。SKM-1細胞中p21和p27表達微量,但是C-MYC表達較高,而DAC處理后可以導致p21和p27表達顯著上調、C-MYC表達顯著降低。此外DAC可以上調凋亡相關蛋白Bim,但是對FasL表達的影響不顯著。 結論：DAC可以誘導SKM-1細胞向單核細胞分化,伴隨細胞周期阻滯和細胞凋亡升高。DAC誘導SKM-1分化過程中伴隨Foxo3a表達升高、p-Foxo3a降低,顯示DAC可以誘導SKM-1細胞中Foxo3a活化,激活其對下游分子的轉錄活性。 第二部分Foxo3a在DAC誘導SKM-1細胞分化、周期、凋亡中的作用研究目的： 1、明確Foxo3a對SKM-1細胞分化、周期、凋亡的影響； 2、明確Foxo3a在DAC誘導SKM-1細胞分化、周期、凋亡中的作用； 研究方法： 1、使用siRNA短暫沉默SKM-1細胞中Foxo3a表達后,使用流式檢測SKM-1細胞表面分子CD14和CD11b的變化及凋亡、周期改變,Western Blot檢測相應分子表達變化； 2、DAC與Foxo3a siRNA聯(lián)合處理SKM-1后,使用流式檢測SKM-1細胞表面分子CD14和CD11b的變化及凋亡、周期改變,Western Blot檢測相應分子表達變化。 結果： 1、短暫沉默SKM-1細胞中Foxo3a表達后對SKM-1細胞表面標記物CD14、CD11b表達、周期和凋亡無明顯影響,但是Western Blot檢測結果顯示,Foxo3a短暫沉默后與周期相關的p21、p27蛋白和與凋亡相關的Bim蛋白表達均降低,原癌蛋白C-MYC表達上調； 2、DAC與Foxo3a siRNA聯(lián)合處理后可以部分逆轉DAC單獨應用所誘導的SKM-1細胞單核細胞分化、周期阻滯和凋亡誘導效應,此過程伴隨p21、p27和凋亡相關蛋白Bim表達改變,但是對C-MYC無明顯影響。 結論： Foxo3a活化參與了DAC誘導的SKM-1細胞向單核細胞分化、周期阻滯和凋亡誘導效應,活化誘導的靶基因p21、p27和Bim蛋白表達上調可能與此相關。 第三部分Foxo3a在地西他濱誘導MDS細胞株SKM-1自噬中的作用 研究目的： 1、明確DAC處理對SKM-1細胞自噬水平及自噬相關蛋白Atg12、Atg16、Atg5和自噬調控蛋白Belcinl表達影響; 2、明確Foxo3a對SKM-1細胞中自噬及其相關蛋白表達的關系及在DAC誘導SKM-1細胞自噬中的作用。 研究方法： 1、Western Blot檢測DAC處理不同時間段SKM-1細胞中自噬標記蛋白LC3和自噬相關蛋白Atg12、Atg16、Atg5、自噬調控蛋白Belcinl表達水平； 2、SiRNA干擾Foxo3a后觀察Foxo3a表達下調在SKM-1細胞自噬中的作用； 3、Foxo3a siRNA與DAC聯(lián)合處理SKM-1細胞后觀察SKM-1細胞中自噬標記蛋白LC3和自噬相關蛋白Atg12、Atg16、Atg5及自噬調控蛋白Belcinl表達水平改變。 結果： 1、DAC處理誘導SKM-1細胞中自噬標記蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達升高及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高；此外,自噬相關蛋白Atg12、Atg16、Atg5和自噬調控蛋白Belcinl在DAC處理后均升高,說明DAC可以上調SKM-1細胞自噬水平； 2、SiRNA干擾SKM-1細胞中Foxo3a表達可以下調LC3蛋白表達,其中對LC3-I下調作用比LC3-II明顯,此過程伴隨Atg12、Atg16Atg5和Belcin1蛋白表達降低； 3、Foxo3a siRNA與DAC聯(lián)合處理可以降低DAC單獨使用所誘導的自噬及自噬相關蛋白表達。 結論： DAC誘導SKM-1細胞中與自噬誘導相關的Belcinl及自噬成核、延伸相關的Atg5、Atg12、Atg16蛋白表達上調、促進細胞自噬水平升高,此過程與轉錄因子Foxo3a表達上調及活化有關。
[Abstract]:The effect of SKM-1 differentiation, cycle, apoptosis and the influence on the expression of Foxo3a and its downstream related molecules in the first part of the MDS cell line
The purpose of the study is:
1, the effect of low concentration of DAC on the differentiation, cycle and apoptosis of SKM-1 cells at different time was determined.
2, the changes of Foxo3a and p-Foxo3a in SKM-1 cells were determined after different time of DAC treatment.
3, the effect of DAC treatment on the expression of SKM-1 cell cycle and apoptosis related protein p21, p27, C-MYC, Bim and FasL at different time was determined.
Research methods:
L, flow cytometry was used to detect the dynamic changes in the surface molecules of SKM-1 cells (CD14 and CD11b) after DAC treatment at different time.
2, flow cytometry was used to detect the dynamic changes of SKM-1 cell cycle after DAC treatment at different time.
3, Hochest33342 and Annexin-V-FITC/PI double staining were used to detect the apoptosis of SKM-1 after DAC treatment for 0-6d.
4, Western Blot detected the expression of Foxo3a, p-Foxo3a, p21, p27, C-MYC, Bim and FasL in SKM-1 cells after different times of DAC treatment.
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本文編號：1594232