發(fā)布時間：2018-02-17 00:42

  本文關鍵詞： 橘青霉 llm3 美伐他汀 無性繁殖 次級代謝　出處：《西南大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:絲狀真菌是天然產(chǎn)物的寶庫,從絲狀真菌中分離的次級代謝產(chǎn)物大約有1500多種,一半以上的次級代謝產(chǎn)物都具有抗菌,抗腫瘤等活性。青霉素、環(huán)孢菌素、頭孢菌素、辛伐他汀、多柔比星、阿維霉素等藥物均來自絲狀真菌。近年來研究表明,絲狀真菌基因組中大量次級代謝基因簇處于沉默狀態(tài)。在絲狀真菌中,次級代謝基因簇的轉錄和翻譯受到多種因子的調控,如全局性調控因子LaeA、途徑特異性調控因子(含有鋅指結構的轉錄調控因子)和表觀遺傳等。他們共同調控絲狀真菌生長發(fā)育和次級代謝基因簇的表達。全局性調控因子LaeA是2004年在構巢曲霉中發(fā)現(xiàn),它含有保守的甲基轉移酶結合位點,且該保守位點和絲狀真菌生長發(fā)育密切相關,可以促進基因簇的轉錄和翻譯,從而調節(jié)絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的合成。2008年在構巢曲霉中發(fā)現(xiàn)LaeA可以和VeA/VelB在細胞核內形成蛋白三聚體,調節(jié)構巢曲霉的生長發(fā)育和次級代謝。2013年,在構巢曲霉中,發(fā)現(xiàn)了LaeA同源的甲基轉移酶LlmF,位于細胞質中,也可以和VeA/VelB在細胞質中形成三聚體,調節(jié)次級代謝和生長發(fā)育。LaeA和Lae A類似的甲基轉移酶蛋白成為研究熱點,研究方向更多的集中在甲基轉移酶蛋白Llm調控絲狀真菌的全局網(wǎng)絡。橘青霉是美伐他汀產(chǎn)生菌,目前對于橘青霉次級代謝和生長發(fā)育的研究還比較少,基因組數(shù)據(jù)分析顯示橘青霉中存在大量未知的次級代謝基因簇,其合成次級代謝的潛力還未被充分挖掘。本課題組已經(jīng)報道了全局性調控因子LaeA、VeA正向調節(jié)橘青霉美伐他汀的生物合成,基因組測序獲得橘青霉基因組序列框架圖,但是在橘青霉中是否存在其他的甲基轉移酶以及這些蛋白是否參與橘青霉次級代謝和生長發(fā)育的調節(jié)還未見報道。本課題在獲得橘青霉基因組框架圖的基礎上,分析橘青霉基因組中潛在的甲基轉移酶,成功獲得9個含有adomet_mtases結構域的蛋白,并重點分析了llm3的功能。通過農(nóng)桿菌和原生質體轉化的方法獲得了橘青霉llm3過表達和敲除菌株,探索llm3對橘青霉生長發(fā)育和次級代謝合成的影響。目的:利用農(nóng)桿菌介導的轉化和原生質體轉化構建了橘青霉llm3過表達菌株(oe::llm3菌株)和llm3敲除菌株(Δllm3菌株),分析橘青霉oe::llm3菌株、Δllm3菌株和wt菌株之間菌落菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量、美伐他汀產(chǎn)量等的差異,探究橘青霉中l(wèi)lm3對次級代謝和生長發(fā)育的影響。方法:1.提取橘青霉基因組,利用illuminahiseq測序技術,獲得橘青霉基因組框架圖;2.通過本地blast獲得橘青霉中含有adomet-mtases結構域的蛋白,用進化樹分析各蛋白之間同源關系,用rt-pcr獲得橘青霉llm3的cdna序列,分析llm3蛋白質序列中的保守位點;3.在pyeu和pgihtgi載體的基礎上構建敲除和過表達載體,所構建載體利用酶切和測序進行驗證。將驗證好的過表達質粒pgihtgi-llm3轉入農(nóng)桿菌lba4404中,通過潮霉素抗性篩選和pcr驗證獲得橘青霉llm3過表達菌株。利用原生質體將pyeu質粒中6.1kb的敲除片段轉入橘青霉中,利用潮霉素抗性初篩和pcr驗證獲得敲除敲除菌株;4.通過菌落培養(yǎng)、顯微鏡觀察和血球計數(shù)板計數(shù)分析wt菌株、oe::llm3菌株和Δllm3菌株在黑暗條件下的菌絲、菌落和孢子產(chǎn)量差異。利用rt-qpcr技術分析三株菌中孢子形成關鍵基因abaa和brla的轉錄差異;5.在pga培養(yǎng)基中發(fā)酵wt菌株、oe::llm3菌株和Δllm3菌株,通過hplc檢測三株菌的美伐他汀產(chǎn)量,利用rt-qpcr技術分析美伐他汀合成基因簇中mlcr、mlcb的轉錄差異。結果:1.橘青霉基因組大小為31.34mb,一共有716個contigs;2.通過橘青霉本地blast,成功鑒定了橘青霉中9個甲基轉移酶,生物信息學分析llm3的結構和功能;3.成功獲得了oe::llm3和Δllm3菌株。4.llm3抑制橘青霉的無性繁殖。oe::llm3菌株的菌落顏色較淺,Δllm3菌株菌落顏色較深,oe::llm3菌株孢子產(chǎn)量較wt菌株少,而Δllm3菌株孢子產(chǎn)量較wt菌株多。oe::llm3菌株中分生孢子發(fā)育相關基因abaa和brla的表達量明顯降低,Δllm3菌株中分生孢子發(fā)育相關基因abaA和brlA的表達量顯著提高。5.llm3調控美伐他汀生物合成。在發(fā)酵第四天,WT菌株美伐他汀產(chǎn)量達到最大值,隨后美伐他汀產(chǎn)量下降。而過表達llm3后,美伐他汀產(chǎn)量從第四天開始增加,且持續(xù)積累,一直到第八天,產(chǎn)量還處于上升趨勢,llm3敲除后,美伐他汀產(chǎn)量和野生型趨勢相似,但是比野生型低。結論:在橘青霉中,llm3參與調節(jié)橘青霉的生長發(fā)育和次級代謝,llm3抑制橘青霉無性發(fā)育過程,且正向調控美伐他汀生物合成。一方面,Llm3通過抑制分生孢子合成途徑關鍵基因abaA和brlA的轉錄,從而抑制分生孢子的形成;另一方面,Llm3通過激活美伐他汀合成基因簇調控基因mlcR的轉錄促進合成基因的轉錄和表達。橘青霉中新的全局調控因子llm3對橘青霉生長發(fā)育和美伐他汀生物合成的研究有助于豐富橘青霉復雜的次級代謝調控途徑及其機制的闡明。
[Abstract]:In this study , we found that LaeA and VeA / VelB can be used to regulate the growth and development of filamentous fungi . The effects of llm3 on secondary metabolism and growth and development of Penicillium citrinum were studied by means of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . Conclusion : In Penicillium citrinum , llm3 is involved in the regulation of growth and secondary metabolism of Penicillium citrinum , llm 3 inhibits the development of Penicillium citrinum and regulates the biosynthesis of mevastatin . On the one hand , Llm3 inhibits the formation of conidium by inhibiting the transcription of genes abaA and brlA .

【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R915

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本文編號：1516818