發(fā)布時(shí)間：2018-01-21 04:09

  本文關(guān)鍵詞： 大型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1 主動(dòng)靶向 谷氨酸 PLGA納米粒 活性調(diào)控　出處：《沈陽藥科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前可供腫瘤主動(dòng)靶向納米制劑選擇的受體種類較少,且其配體具有分子量大和體內(nèi)穩(wěn)定性差等問題,尋找新的有效靶點(diǎn)是腫瘤主動(dòng)靶向納米制劑設(shè)計(jì)中亟待解決的難點(diǎn)。對(duì)于腫瘤細(xì)胞表面特異性高表達(dá)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,簡單的氨基酸修飾即可達(dá)到靶向目的,且氨基酸具有空間位阻小,體內(nèi)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。因此,本課題以腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的大中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(LAT1)為靶點(diǎn),谷氨酸為靶頭,制備具有LAT1靶向性的PLGA納米粒,考察靶向納米粒在腫瘤細(xì)胞中的攝取能力和腫瘤組織中的滯留性,探索LAT1成為新型腫瘤靶向策略的可行性。首先,利用聚乙二醇單硬脂酸酯的羥基與N-芐氧羰基-L-谷氨酸-1-芐酯的羧基之間的酯化反應(yīng),成功制備了具有不同PEG鏈長的谷氨酸-聚乙二醇單硬脂酸酯靶向材料。采用'H-NMR對(duì)靶向材料的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,GPC對(duì)靶向材料的分子量及其分子量分布進(jìn)行考察。結(jié)果表明,氨基酸成功地修飾于聚乙二醇單硬脂酸酯的PEG鏈末端,并且該合成過程簡便易行,重復(fù)性高；GPC結(jié)果證明該靶向材料具有較好的純度。以紫杉醇(PTX)為模型藥物,谷氨酸-聚乙二醇單硬脂酸酯為修飾材料,PLGA為藥物儲(chǔ)庫,采用乳化溶劑揮發(fā)法制備不同PEG鏈長、不同配體修飾度的載藥納米粒(5% SPGn PTXNPs和10% SPGn PTX NPs)。所制備的載藥納米粒的包封率在70～95%,載藥量在4%左右。納米粒的粒徑在152 nm～181 nm,TEM電鏡結(jié)果顯示納米粒呈球形,粒徑均勻。利用透析法考察了載藥納米粒的體外釋放行為,結(jié)果表明延長PEG鏈或增加修飾材料的密度均能降低PTX的體外釋放速度。以粒徑為指標(biāo),考察了不同靶向納米粒在10% FBS中的穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,靶向納米粒具有較好的穩(wěn)定性。以MCF-7、HeLa腫瘤細(xì)胞和NIH 3T3成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,利用免疫熒光法定性觀察LAT1在所選擇細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,MCF-7和HeLa細(xì)胞高表達(dá)LAT1、NIH 3T3細(xì)胞低表達(dá)LAT1。以非靶向納米粒為對(duì)照,考察不同配體修飾度和不同PEG鏈長的靶向納米粒的在MCF-7、HeLa腫瘤細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中的LAT1靶向效果、細(xì)胞毒性、內(nèi)涵體／溶酶體逃逸及細(xì)胞結(jié)合、攝取機(jī)制。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,靶向納米粒表面配體修飾度的增加有利于增強(qiáng)納米粒對(duì)細(xì)胞的抑制能力。細(xì)胞攝取結(jié)果表明,靶向納米粒能提高未修飾納米粒在LAT1高表達(dá)細(xì)胞中的攝取,而在LAT1低表達(dá)細(xì)胞中靶向納米粒沒有表現(xiàn)明顯的攝取優(yōu)勢(shì)。當(dāng)靶向修飾度為10%,PEG分子量為1000時(shí),細(xì)胞攝取提高更為明顯,結(jié)合納米粒的體外研究,確定10% SPG25 NPs為最佳LAT1靶向納米粒。采用激光共聚焦定性觀察靶向納米粒的亞細(xì)胞器分布情況,發(fā)現(xiàn)靶向納米粒具有一定的內(nèi)涵體/溶酶體逃逸能力。細(xì)胞內(nèi)吞抑制實(shí)驗(yàn)表明靶向納米粒主要以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。在低溫條件下,考察了LAT1的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,結(jié)果表明靶向納米粒能與LAT1發(fā)生結(jié)合,且對(duì)于LAT1介導(dǎo)的內(nèi)吞,結(jié)合是細(xì)胞內(nèi)吞的限速步驟。在37-C孵化條件下,通過競爭性抑制實(shí)驗(yàn)證明靶向納米粒是通過LAT1介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。采用免疫熒光法和Western blot初步考察在靶向納米粒的細(xì)胞內(nèi)吞過程中對(duì)LAT1的影響,結(jié)果表明,靶向納米粒結(jié)合細(xì)胞膜上的LAT1后,經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,隨著內(nèi)涵體酸化或離子強(qiáng)度的變化,LAT1和靶向納米粒表面的谷氨酸結(jié)合力減弱并分離,靶向納米粒進(jìn)入溶酶體,LAT1返回至細(xì)胞膜上,從而保證了細(xì)胞膜上有足夠的LAT1與細(xì)胞外的靶向納米粒結(jié)合、內(nèi)吞。以4T1荷瘤小鼠為模型,利用活體成像儀考察靶向和非靶向納米粒在荷瘤小鼠中的組織分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PEG化修飾能顯著降低納米粒的肝脾吞噬,谷氨酸修飾提高了靶向納米粒在腫瘤部位的蓄積。以4T1荷瘤小鼠為模型,評(píng)價(jià)Taxol溶液劑、10% SP25 PTX NPs和10% SPG25 PTX NPs的抑瘤效果。與生理鹽水組相比,給藥組明顯抑制腫瘤的生長,且10% SPG25 PTX NPs靶向納米粒具有更好的腫瘤抑制效果。同時(shí),與Taxol相比,10% SPG25 PTX NPs具有更好的安全性。此外,研究表明LAT1在血腦屏障和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞上均高表達(dá),并且LAT1在血腦屏障上對(duì)底物的親和性遠(yuǎn)高于在其他組織中的LAT1。在前期研究基礎(chǔ)上,合成了谷氨酸-TPGS修飾材料,制備谷氨酸修飾的脂質(zhì)體,對(duì)該脂質(zhì)體進(jìn)行了體外制劑學(xué)評(píng)價(jià),大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的毒性試驗(yàn)和攝取試驗(yàn),以及小鼠體內(nèi)跨血腦屏障的初步研究。結(jié)果表明,與未修飾的脂質(zhì)體相比,谷氨酸修飾促進(jìn)了非靶向脂質(zhì)體的細(xì)胞抑制能力,細(xì)胞攝取和跨血腦屏障能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：1450423