本文關(guān)鍵詞：蓖麻毒素誘導(dǎo)小鼠肺損傷修復(fù)及致炎機(jī)制初步研究

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【摘要】：蓖麻毒素(Ricin Toxin,RT)是蓖麻籽中提取的毒蛋白,是由A鏈和B鏈通過(guò)二硫鍵連接形成的分子量約為65kDa的二聚體毒素,是Ⅱ型核糖體失活蛋白。RT的毒性作用具有明顯劑量依賴(lài)性,高劑量RT主要表現(xiàn)為抑制蛋白質(zhì)合成的毒性,而在低劑量范圍內(nèi)RT表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。不同接觸途徑,如攝入、肌內(nèi)注射或吸入后可產(chǎn)生不同的毒性作用。吸入產(chǎn)生的毒性作用相對(duì)于其他途徑是最強(qiáng)的,可造成嚴(yán)重的肺損傷,引起壓迫性的彌漫性肺泡水腫,由大量活化的巨噬細(xì)胞引起急性肺泡炎,伴隨著肺間質(zhì)嚴(yán)重的毛細(xì)血管充血和滲透。RT一旦進(jìn)入肺部,能與各種類(lèi)型的細(xì)胞結(jié)合。一旦結(jié)合,核糖體活性被抑制,隨后細(xì)胞快速凋亡。RT通過(guò)B鏈結(jié)合半乳糖殘基進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),此半乳糖殘基存在于大多數(shù)細(xì)胞的表面。巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體,具有結(jié)合甘露糖或巖藻糖基糖蛋白的能力。RT既可結(jié)合殘留的半乳糖殘基,又可結(jié)合巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體。巨噬細(xì)胞既參與先天免疫又參與適應(yīng)性免疫,具有吞噬異物的功能。天然免疫是機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線(xiàn),細(xì)胞通過(guò)其表面或細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體來(lái)識(shí)別入侵的病原微生物。TLR4是常見(jiàn)的研究較多的模式識(shí)別受體,是Toll樣受體家族的重要成員,參與天然免疫。組織細(xì)胞損傷后,釋放炎性介質(zhì),與TLR4結(jié)合后,啟動(dòng)相關(guān)的信號(hào)通路,促進(jìn)炎性因子的釋放。TLR4信號(hào)通路分為MyD88依賴(lài)途徑與TRIF依賴(lài)途徑。目前針對(duì)RT的研究,集中于采用超致死劑量與亞致死劑量的RT暴露損傷后,觀(guān)察機(jī)體的炎癥反應(yīng)及相應(yīng)的組織病理變化,針對(duì)低劑量RT引起損傷的研究報(bào)道較少。本研究包括以下兩個(gè)部分內(nèi)容:(1)RT誘導(dǎo)小鼠肺損傷修復(fù)的研究采用改良寇氏法測(cè)得小鼠霧化吸入RT的LD50約為4.95±0.14μg/kg。暴露濃度約為1/30 LD50(約164ng/kg)時(shí),組織病理學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn),12小時(shí)肺組織出現(xiàn)明顯的病理變化,正常的肺泡結(jié)構(gòu)破壞,支氣管周發(fā)生水腫,平滑肌增厚。24小時(shí)、第2天損傷加劇。第3、4天損傷最為嚴(yán)重。第5、6天后損傷程度較之前小,血管周?chē)乃[部分消除。支氣管周?chē)[消失,第7天與空白組相比,肺泡結(jié)構(gòu)仍未恢復(fù)到正常狀態(tài)。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,正常組織MMP-2、MMP-9的表達(dá)呈弱陽(yáng)性。吸入RT后,12小時(shí)肺組織MMP-2、MMP-9的表達(dá)均略微增加。24小時(shí)、第2天損傷加劇。與空白組及實(shí)驗(yàn)組相比第3天的MMP-2的表達(dá)最高,第4天實(shí)驗(yàn)組的MMP-9表達(dá)最高。第5、6天表達(dá)降低,第7天呈弱陽(yáng)性,基本恢復(fù)至正常水平�？傊�,隨著肺組織損傷加重,MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)增加,當(dāng)組織損傷逐漸修復(fù)時(shí)MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)也逐漸下降,基本恢復(fù)至正常水平。說(shuō)明此劑量的肺損傷,在一定時(shí)間內(nèi)可自我修復(fù)。(2)小鼠肺損傷的致炎機(jī)制初步研究用于實(shí)驗(yàn)研究的肺泡巨噬細(xì)胞不僅需要保證純度,同時(shí)也需要確保其活性。采用支氣管肺泡灌洗法分離得到的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞呈圓形,大小不等,培養(yǎng)2~3小時(shí)后大部分細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng),培養(yǎng)1~2天后細(xì)胞開(kāi)始變形。采用瑞氏-姬姆薩染色法與Diff-Quik染色法鑒定肺泡巨噬細(xì)胞的純度,結(jié)果顯示:前者背景雜質(zhì)較多,可見(jiàn)許多沉積的染色雜質(zhì),且染色時(shí)間較長(zhǎng);后者染色結(jié)果清晰,背景干凈無(wú)雜質(zhì),染色時(shí)間短。說(shuō)明Diff-Quik染色法可以代替瑞氏-姬姆薩染色法,成為一種簡(jiǎn)捷高效的鑒定肺泡巨噬細(xì)胞純度的方法。FITC標(biāo)記細(xì)菌與肺泡巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方法鑒定細(xì)胞活性,結(jié)果顯示:肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)隨著FITC標(biāo)記細(xì)菌與肺泡巨噬細(xì)胞比例的增加而增大,在給定的比例范圍內(nèi),細(xì)菌與細(xì)胞比例為20:1時(shí)吞噬率和吞噬指數(shù)達(dá)到最大,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),吞噬率和吞噬指數(shù)呈先升高再降低的趨勢(shì)。小鼠吸入1/150 LD50(約33ng/kg)濃度的RT后,Elisa方法檢測(cè)3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí),這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺泡灌洗液上清炎癥因子的含量變化,結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)先增加后降低的趨勢(shì),在12小時(shí)時(shí)表達(dá)量最高,相比于空白組差異顯著(0.01p0.05)。而IL-6的表達(dá)也是呈先增加后降低的趨勢(shì),表達(dá)量在48小時(shí)最高。灌洗液上清總蛋白的表達(dá)也是呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),總蛋白濃度在60小時(shí)最高。同時(shí)在3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)提取肺泡巨噬細(xì)胞,半定量RT-PCR方法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞上TLR4及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4的表達(dá)量在12小時(shí)高于其他時(shí)間點(diǎn),并且呈一個(gè)先增加后下降的趨勢(shì);而TRIF、TRAM的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異(p0.05)。說(shuō)明RT引起TLR4信號(hào)通路的反應(yīng)主要通過(guò)MyD88途徑起作用的。這與前期本課題組研究的RT體外刺激Raw264.7細(xì)胞,引起TLR4及其信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)增加的結(jié)果一致。本研究結(jié)論:小鼠吸入1/30 LD50劑量RT引起的肺損傷,通過(guò)檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),肺組織可在7天內(nèi)出現(xiàn)自我修復(fù);小鼠吸入1/150 LD50劑量RT,72小時(shí)內(nèi)可刺激肺泡巨噬細(xì)胞TLR4及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4等相關(guān)因子mRNA的表達(dá),引起肺部炎癥反應(yīng)。本研究為進(jìn)一步闡明RT誘導(dǎo)炎性損傷及修復(fù)機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R996.2

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1 詹素云;快速簡(jiǎn)便提取蓖麻毒素[J];宜春醫(yī)專(zhuān)學(xué)報(bào);1989年Z1期

2 董巨瑩,藥立波,彭宣憲,蘇成芝;蓖麻毒素對(duì)肝癌細(xì)胞有絲分裂原激活蛋白激酶的影響[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2000年06期

3 葛利萍,詹金彪;蓖麻毒素在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究進(jìn)展[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年06期

4 郭雷鳴;馮健男;黎燕;;蓖麻毒素A鏈與底物作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其解毒劑的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊(cè);2006年01期

5 王俊虹;康琳;高姍;賈楊;王景林;;蓖麻毒素及其檢測(cè)技術(shù)[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2007年02期

6 王英;邱澤武;;蓖麻毒素中毒與救治[J];藥物不良反應(yīng)雜志;2007年03期

7 馮玉奎;張立營(yíng);孫宇;孫英姿;;利用生物條形碼技術(shù)對(duì)蓖麻毒素進(jìn)行微量檢測(cè)[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2010年10期

8 武軍華;李倩;董娜;王玉霞;賈培媛;梁曉;趙元忠;;膨化脫毒處理后蓖麻籽粕中蓖麻毒素的檢測(cè)[J];軍事醫(yī)學(xué);2013年01期

9 王蒙;錢(qián)軍;穆成龍;趙思言;鄭關(guān)雨;付瑩瑩;孫玉成;萬(wàn)家余;劉文森;劉林娜;;蓖麻毒素對(duì)原代培養(yǎng)小鼠肺泡上皮細(xì)胞的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2013年08期

10 王文學(xué),郭正仁;簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的蓖麻毒素提取分離法[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1985年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 劉林娜;高宏偉;劉寧;李吉平;孫玉成;劉文森;萬(wàn)家余;;蓖麻毒素對(duì)小鼠腸道損傷機(jī)制的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物毒物學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 曹曦元;彭暉;郭雷鳴;馮健男;沈倍奮;黎燕;;蓖麻毒素A鏈拮抗小分子化合物的生物學(xué)評(píng)價(jià)[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

3 尹惠瓊;賈茗嫻;楊姝;王升啟;章金剛;;蓖麻毒素新型納米探針免疫檢測(cè)技術(shù)[A];第五次全國(guó)免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2011年

4 詹金彪;陳永對(duì);王克夷;;蓖麻毒素A鏈與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)肽KDEL融合蛋白的表達(dá)與細(xì)胞毒性研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要集[C];2003年

5 劉冰;童朝陽(yáng);郝蘭群;穆唏惠;田艷慧;;納米金在壓電免疫傳器檢測(cè)蓖麻毒素研究中的應(yīng)用[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第二十五屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集（下冊(cè)）[C];2006年

6 郭建巍;王順濤;郭黎明;馬驄;馮健男;沈倍奮;;重組蓖麻毒素A鏈的原核表達(dá)和單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

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1 康p樁，

本文編號(hào)：1305821