本文關(guān)鍵詞：鉑—唑來膦酸配合物的抗腫瘤活性及作用機制研究

  更多相關(guān)文章： 鉑-唑來膦酸配合物 人胃癌細胞SGC7901 細胞周期阻滯 凋亡 法尼醇

【摘要】：目的探討鉑-唑來瞵酸配合物{[Pt(en)]2ZL}對多種腫瘤細胞的抗腫瘤活性,并初步研究該化合物抑制人胃癌細胞SGC7901增殖的可能機制。方法運用傳統(tǒng)MTT方法來測定{[Pt(en)]2ZL}所影響的多種腫瘤細胞存活率,以及后期加入FOH時的腫瘤細胞存活率變化。平板克隆實驗用于檢測{[Pt(en)]2ZL}對人胃癌細胞SGC7901增殖情況的影響。細胞衰老半乳糖苷酶染色與免疫熒光染色分別用來觀察此配合物引起的SGC7901衰老及微管動態(tài)平衡方面的改變。選用適當(dāng)?shù)臒晒馊旧?PI單染、Hochest 33342/PI熒光雙染、JC-1單染、TUNEL實驗、Annexin V/PI雙染)進行熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀定量分析{[Pt(en)]2ZL}及法尼醇(FOH)的加入對SGC7901細胞周期和凋亡的影響。AO熒光染色可用于觀察此配合物引起的細胞自噬相關(guān)形態(tài)學(xué)變化。Western blot可用于半定量觀測{[Pt(en)]2ZL}所引起的細胞周期相關(guān)蛋白(p53、p21、Cyclin D1, Cyclin E和CDK2),細胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,Bax,caspase 3,PARP及survivin),細胞自噬相關(guān)蛋白LC3以及小G蛋白家族相關(guān)蛋白(Ras和RhoA)的表達水平的變化。結(jié)果{[Pt(en)]2ZL}對多種腫瘤細胞具有良好的抗腫瘤活性(如：對胃癌細胞SGC7901和MGC803的IC50值分別為25.15±0.75和38.52±3.00μM),且目前對人胃癌細胞SGC7901最為顯著,并觀察到胃癌細胞在藥物作用后會出現(xiàn)衰老及微管動態(tài)平衡形態(tài)及功能方面的改變,并進一步檢測到其細胞周期阻滯在G1/S期(99.99%),且細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白(p53.p21.Cyclin E和CDK2表達水平上調(diào),Cyclin D1的表達水平下調(diào))的表達水平也相應(yīng)改變。與此同時,在熒光染色下SGC7901也出現(xiàn)了明顯的凋亡形態(tài)和功能變化,而Annexin V/PI雙染更能定量觀測到凋亡發(fā)生的比例(早凋和晚凋的比例分別可升至20.5%和25.3%),.且細胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,caspase 3酶原,PARP酶原及survivin表達水平下調(diào),Bax及剪切后PARP表達水平上調(diào))的表達水平亦發(fā)生變化。而FOH的加入,可以削弱{[Pt(en)]2ZL}引起的細胞增殖抑制(IC50值升至84.43±4.04μM)、細胞周期阻滯(G2/M期升至9.17±1.12%)和凋亡(早凋和晚凋的比例分別降至6.12±3.51%和5.36±0.53%),并引起小G蛋白家族(Ras和RhoA酶原表達水平下調(diào),非異戊烯化的Ras和RhoA表達水平上調(diào))的表達水平的變化。另外,AO熒光染色及LC3蛋白表達水平的檢測發(fā)現(xiàn){[Pt(en)]2ZL}可引起SGC7901發(fā)生自噬相關(guān)的形態(tài)和分子水平方面的改變。結(jié)論鉑-唑來膦酸配合物{[Pt(en)]2ZL}對多種腫瘤細胞具有良好的抗腫瘤活性,尤以對人胃癌細胞SGC7901較為突出。目前的研究表明{[Pt(en)]2ZL}對人胃癌細胞SGC7901通過細胞周期阻滯和誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮良好的抗增殖活性。其中G1/S期阻滯與化合物對細胞周期調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的p53-p21-Cyclin D支路的調(diào)節(jié)相關(guān)。而誘導(dǎo)細胞凋亡可能與caspase級聯(lián)反應(yīng)以及胞內(nèi)PARP相關(guān)凋亡活動的激活相關(guān)。另外,FOH以及細胞自噬均有可能在{[Pt(en)]2ZL}所引起抗腫瘤活性中發(fā)揮重要作用。由此可知,{[Pt(en)]2ZL}在治療胃癌方面,可以成為一種具有優(yōu)良抗腫瘤潛力的化療藥物。
【關(guān)鍵詞】：鉑-唑來膦酸配合物 人胃癌細胞SGC7901 細胞周期阻滯 凋亡 法尼醇
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R96
【目錄】：

• 中英文對照表8-10
• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 前言14-20
• 參考文獻17-20
• 第一部分 鉑-唑來膦酸配合物對腫瘤細胞的增殖影響20-32
• 引言20
• 材料與方法20
• 1 材料20-22
• 1.1 細胞株與鉑-唑來膦酸配合物20
• 1.2 儀器20-21
• 1.3 試劑21
• 1.4 常用緩沖液配制21-22
• 2 實驗方法22-24
• 2.1 細胞培養(yǎng)和處理22-23
• 2.2 細胞存活率的測定23
• 2.3 平板克隆形成實驗23-24
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理24
• 3 實驗結(jié)果24-29
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}對腫瘤細胞增殖的影響24-27
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901的細胞毒性研究27-28
• 3.3 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901形成細胞克隆能力的影響28-29
• 討論29-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻31-32
• 第二部分 鉑-唑來膦酸配合物對人胃癌細胞SGC7901周期的影響32-48
• 引言32-33
• 材料與方法33
• 1 材料33-36
• 1.1 細胞株(參見第一部分)33
• 1.2 儀器33-34
• 1.3 試劑34
• 1.4 常用緩沖液的配制34-36
• 2 實驗方法36-41
• 2.1 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布36-37
• 2.2 細胞衰老半乳糖苷酶染色37
• 2.3 免疫熒光染色觀測微管結(jié)構(gòu)37
• 2.4 Western Blot法37-41
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)處理(實驗方法參見第一部分)41
• 3 實驗結(jié)果41-45
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901細胞周期分布的影響41-42
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901衰老的影響42-43
• 3.3 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901的微管動態(tài)平衡的影響43
• 3.4 {[Pt(en)]_2ZL}影響人胃癌細胞SGC7901內(nèi)細胞周期相關(guān)蛋白的表達43-45
• 討論45-46
• 結(jié)論46
• 參考文獻46-48
• 第三部分 鉑-唑來膦酸配合物對人胃癌細胞SGC7901凋亡的影響48-62
• 引言48-49
• 材料與方法49
• 1 材料49-50
• 1.1 細胞株(參見第一部分)49
• 1.2 儀器(參見第二部分)49
• 1.3 試劑49-50
• 1.4 常用緩沖液的配制50
• 2 實驗方法50-52
• 2.1 Hoechst 33342/PI雙染50-51
• 2.2 線粒體膜電位檢測51
• 2.3 TUNEL染色法檢測細胞凋亡51
• 2.4 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測51-52
• 2.5 Western Blot法(實驗方法參見第二部分)52
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)處理(實驗方法參見第一部分)52
• 3 實驗結(jié)果52-58
• 3.1 Hoechst/PI雙染對細胞凋亡形態(tài)的評價52-53
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901線粒體膜電位的影響53-54
• 3.3 TUNEL法檢測細胞凋亡54-55
• 3.4 Annxin V-FITC/PI細胞凋亡檢測盒檢測凋亡發(fā)生率55-56
• 3.5 {[Pt(en)]_2ZL}影響人胃癌細胞SGC7901內(nèi)細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達56-58
• 討論58-60
• 結(jié)論60
• 參考文獻60-62
• 第四部分 鉑-唑來膦酸配合物對人胃癌細胞SGC7901中甲羥戊酸途徑的影響62-73
• 引言62
• 材料與方法62
• 1 材料62-63
• 1.1 細胞株(參見第一部分)63
• 1.2 儀器(參見第二部分)63
• 1.3 試劑63
• 1.4 常用緩沖液的配制63
• 2 實驗方法63
• 2.1 FOH和GGOH對{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細胞SGC7901存活率的影響(實驗方法參見第一部分)63
• 2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布(實驗方法參見第二部分)63
• 2.3 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測(實驗方法參見第三部分)63
• 2.4 Western Blot法(實驗方法參見第二部分)63
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)處理(實驗方法參見第一部分)63
• 3 實驗結(jié)果63-69
• 3.1 FOH和GGOH對{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細胞SGC7901存活率的影響63-65
• 3.2 FOH對{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細胞SGC7901細胞周期阻滯的影響65
• 3.3 FOH對{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細胞SGC7901細胞凋亡的影響65-67
• 3.4 FOH對{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌細胞SGC7901細胞周期和細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平變化的影響67-68
• 3.5 {[Pt(en)]_2ZL}可影響人胃癌細胞SGC7901內(nèi)小G蛋白家族中Ras和RhoA蛋白的表達水平68-69
• 討論69-71
• 結(jié)論71
• 參考文獻71-73
• 第五部分 鉑-唑來膦酸配合物對人胃癌細胞SGC7901中自噬途徑的影響73-79
• 引言73
• 材料與方法73
• 1 材料73-74
• 1.1 細胞株(參見第一部分)73
• 1.2 儀器(參見第二部分)73
• 1.3 試劑73-74
• 1.4 常用緩沖液的配制74
• 2 實驗方法74
• 2.1 AO熒光染色74
• 2.2 Western Blot法(實驗方法參見第二部分)74
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)處理(實驗方法參見第一部分)74
• 3 實驗結(jié)果74-76
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901自噬的影響74-75
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}對人胃癌細胞SGC7901內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達水平的影響75-76
• 討論76-77
• 結(jié)論77
• 參考文獻77-79
• 綜述79-89
• 參考文獻85-89
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況89-90
• 致謝90-91

【參考文獻】

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本文編號：1014953