發(fā)布時間：2017-05-06 18:12

  本文關(guān)鍵詞：Hsf4對溶酶體活性的調(diào)控，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景眼晶狀體蛋白變性形成非透明樣斑塊組織,致使光線不能投射到視網(wǎng)膜形成圖像,這一眼部疾病稱為白內(nèi)障。白內(nèi)障發(fā)病率達(dá)到60%-80%,是導(dǎo)致失明的主要原因,將近50%的失明是由白內(nèi)障引起的。正常情況下,人眼中的晶狀體組織是透明的,光線能夠透過它到達(dá)視網(wǎng)膜,使人們清晰地看到物體。晶狀體由兩種細(xì)胞組成,前囊立方上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞。赤道區(qū)前囊上皮細(xì)胞具有無限增生的能力,并且能持續(xù)向纖維細(xì)胞分化,因此可知晶狀體是一個終生生長的器官。纖維細(xì)胞分為前囊上皮下的皮質(zhì)纖維細(xì)胞和核心區(qū)的終末分化纖維細(xì)胞,終末分化的纖維細(xì)胞能合成大量折疊有序的晶狀體蛋白,并且主動失去細(xì)胞內(nèi)的膜性亞細(xì)胞器(包括細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體等),形成能折射光線的中心透明區(qū)(也稱OFZ,organelle free zone),但纖維細(xì)胞終末分化的去膜性亞細(xì)胞器的機(jī)理還不清楚。有報道發(fā)現(xiàn)溶酶體介導(dǎo)的自噬和泛素-蛋白酶體是調(diào)控去亞細(xì)胞器的主要通路,溶酶體腔內(nèi)的DNaseⅡbeta和水解酶參與晶狀體纖維細(xì)胞核和膜性亞細(xì)胞器的降解,基因敲除DNaseⅡbeta的小鼠晶狀體纖維細(xì)胞脫核障礙,形成非透明的白內(nèi)障。然而,在終末纖維細(xì)胞分化過程中,調(diào)控溶酶體活性的信號通路仍不清楚。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,該家族轉(zhuǎn)錄因子能感受外界和細(xì)胞內(nèi)源性應(yīng)激刺激,上調(diào)熱休克蛋白家族成員的表達(dá),后者通過對變性蛋白的復(fù)性、分割和降解,達(dá)到對細(xì)胞生命的保護(hù),這一過程成為熱休克應(yīng)激反應(yīng)。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4主要表達(dá)在晶狀體、脾、心臟和腦組織中。Hsf4基因突變與家族顯性遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān),基因敲除Hsf4的小鼠發(fā)生先天性白內(nèi)障,主要表現(xiàn)為出生后小鼠晶狀體纖維細(xì)胞分化障礙,終末分化纖維細(xì)胞脫核延遲。Hsf4主要表達(dá)在晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞的核內(nèi)。有報道發(fā)現(xiàn)Hsf4參與調(diào)控DNaseⅡbeta的基因表達(dá)。因此我們推論Hsf4通過調(diào)控纖維細(xì)胞溶酶體活性繼而參與終末分化纖維細(xì)胞的脫核作用。本課題將設(shè)計一系列實驗驗證Hsf4參與調(diào)控纖維細(xì)胞溶酶體活性的分子機(jī)制。目的應(yīng)用小鼠晶狀體上皮細(xì)胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b研究Hsf4調(diào)控溶酶體活性的分子機(jī)制。方法1.收集mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞,用Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比例;應(yīng)用免疫熒光觀察LC3自噬活化顆粒的數(shù)量,揭示Hsf4對自噬通路的調(diào)控作用。2.應(yīng)用表達(dá)GFP-LC3質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞,用雷帕霉素Rapamycin和氯喹Chloroquine分別處理細(xì)胞,Rapamycin激活細(xì)胞內(nèi)的自噬,Chloroquine則抑制溶酶體對自噬小體的降解,應(yīng)用Western-blot檢測GFP-LC3分子中GFP的降解速度,觀察Hsf4對溶酶體活性的檢測;3.不同濃度Chloroquine處理轉(zhuǎn)染GFP-LC3的mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b,Western-blot觀察游離GFP的變化;4.用Western-blot、免疫熒光檢測溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1、LAMP2(溶酶體標(biāo)記物)在mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b的表達(dá)和定位,測定Hsf4對溶酶體數(shù)量和活性的調(diào)控;5.用Magic Red染色,免疫熒光檢測溶酶體內(nèi)Cathepsin B的活性,從而檢測mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b內(nèi)溶酶體Cathepsin B的活性是否受Hsf4b調(diào)控;6.免疫共沉淀CO-IP檢測alpha B-crystallin是否與ATP6VIA有相互作用,驗證Hsf4b是否通過其下游蛋白影響溶酶體活性。結(jié)果1.過表達(dá)Hsf4b導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)增強(qiáng);2.Rapamycin短時間處理,晶狀體上皮細(xì)胞自噬增強(qiáng)。處理時間延長后,mlec-HA-Hsf4b的LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ明顯降低,可能由于Hsf4b促進(jìn)溶酶體活性將更多的LC3-Ⅱ降解;3.Hsf4b能增加GFP-LC3分子中GFP在溶酶體中的降解。晶狀體上皮細(xì)胞經(jīng)雷帕霉素(Rapamycin)處理后,細(xì)胞內(nèi)溶酶體活性整體升高;4.不同濃度氯喹(Chloroquine)處理兩種晶狀體上皮細(xì)胞,可明顯的增加GFP-LC3在mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的堆積,說明Hsf4b能提高溶酶體對GFP分子的降解速度;5.Magic Red染色發(fā)現(xiàn)Hsf4b能增加Cathepsin B的蛋白酶水解活性,直接說明Hsf4b增強(qiáng)溶酶體活性;6.通過Western-blot檢測溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1、LAMP2在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Hsf4b不影響溶酶體的數(shù)量,但通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)Hsf4b影響溶酶體的定位方式。LAMP1以聚積狀態(tài)分布于在mlec-Hsf4b-/-核周,而均勻分布于mlec-HA-Hsf4b核周;LAMP2在mlec-Hsf4b-/-核周均勻分布,而在mlec-HA-Hsf4b細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)都存在;7.CO-IP檢測暫未發(fā)現(xiàn)Hsf4b下游基因cryαb與ATP6VIA有相互作用,仍需進(jìn)一步確定。結(jié)論1.Hsf4促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生;2.Hsf4參與上調(diào)晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)溶酶體的生物活性。
【關(guān)鍵詞】：Hsf4 自噬 溶酶體活性 晶狀體發(fā)育 白內(nèi)障
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R776.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-13
• 引言13-17
• 1 材料、儀器17-23
• 1.1 主要材料與試劑17-23
• 1.1.1 細(xì)胞株、細(xì)菌以及質(zhì)粒來源17
• 1.1.2 主要試劑17-18
• 1.1.3 主要試劑的配制18-21
• 1.1.4 主要儀器21-23
• 2 實驗方法23-31
• 2.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染23-24
• 2.1.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化23
• 2.1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞23-24
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)24-25
• 2.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇24
• 2.2.2 細(xì)胞傳代24
• 2.2.3 細(xì)胞計數(shù)24-25
• 2.2.4 細(xì)胞凍存25
• 2.3 Western Blot25-28
• 2.3.1 提取細(xì)胞蛋白25
• 2.3.2 測蛋白濃度25-26
• 2.3.3 蛋白質(zhì)凝膠電泳26-28
• 2.4 提取細(xì)胞RNA28-29
• 2.5 免疫熒光29
• 2.6 免疫共沉淀29-31
• 3 實驗結(jié)果31-41
• 3.1 Hsf4增強(qiáng)自噬的發(fā)生31-32
• 3.2 Hsf4促進(jìn)雷帕霉素（Rapamycin）誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ的降解32-33
• 3.3 Hsf4增強(qiáng)溶酶體介導(dǎo)的游離GFP的降解33-34
• 3.4 氯喹（Chloroquine）影響Hsf4介導(dǎo)的溶酶體活性34-36
• 3.5 Hsf4增強(qiáng)溶酶體活性36-37
• 3.6 Hsf4不影響溶酶體數(shù)量37-39
• 3.7 檢驗alpha B-crystallin是否與ATP6VIA相互作用39-41
• 4 討論41-45
• 結(jié)論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 致謝61-63
• 在校期間獲得的獎勵和科研成果63-64

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