本文關鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜內(nèi)皮樣細胞分化的初步實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：組織工程角膜是近來興起的一項非常有前景的治療手段，其可克服供體角膜的缺乏和可能發(fā)生的免疫排斥反應等由傳統(tǒng)角膜移植術所帶來的局限。組織工程角膜構建最突出的問題是種子細胞的來源。由于目前大量體外培養(yǎng)獲取人的角膜內(nèi)皮細胞仍面臨著許多困難。因此，尚需進一步尋找其他種類的細胞作為內(nèi)皮細胞的替代細胞。 人臍帶間充質(zhì)干細胞因獲取方便、無創(chuàng)及避免了胚胎干細胞倫理學爭議等優(yōu)點，近年來被廣泛的應用于臨床研究。臍帶間充質(zhì)干細胞可分化為多種間葉組織細胞，其同時在組織和細胞替代治療及再生醫(yī)學方面具有極大的應用價值。眾所周知，人類和嚙齒類動物角膜內(nèi)皮組織起源于神經(jīng)嵴的眼周間葉組織。臍帶間充質(zhì)干細胞在體外可大量擴增并具有多向分化的潛能。因此，其是體外替代角膜內(nèi)皮細胞的理想種子細胞來源。 本研究中，我們通過共培養(yǎng)體系成功將人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導分化成具有類似內(nèi)皮細胞形態(tài)、標志物及功能特性的內(nèi)皮樣細胞。 第一部分：人臍帶間充質(zhì)干細胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立人臍帶間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。 方法：用膠原酶消化法分離人臍帶間充質(zhì)干細胞，并置于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，待其貼壁傳代后于倒置顯微鏡下行細胞形態(tài)學觀察；流式細胞儀檢測其表面抗原表型；堿性磷酸酶及茜素紅染色鑒定其成骨誘導后的鈣質(zhì)沉積，油紅O用于成脂誘導后脂滴染色觀察。 結果：我們利用膠原酶消化法成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞，細胞表達多種抗原表型，如CD29, CD44, CD90和CD105，但不表達造血細胞及與移植排斥相關的抗原表型，如CD14, CD31, CD34, CD40, CD45和HLA-DR。在條件培養(yǎng)中可誘導分化為骨和脂肪細胞。 結論：通過膠原酶消化法可成功分離培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞；分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞具有間充質(zhì)干細胞的抗原表型和具有多向分化的潛能。 第二部分：兔角膜內(nèi)皮細胞的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立兔角膜內(nèi)皮細胞分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。 方法：將帶有角膜內(nèi)皮細胞的后彈力層完整剝離后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液于37℃，5%CO2孵育箱中行消化處理。待角膜內(nèi)皮細胞貼壁傳代后于倒置顯微鏡下行細胞形態(tài)學及HE染色觀察。掃描電鏡觀察兔角膜內(nèi)皮細胞的超微結構，免疫熒光及免疫組織化學染色鑒定其表面蛋白標志物ZO-1（緊密連接蛋白）和NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）。 結果：我們通過后彈力層揭除聯(lián)合胰酶消化法成功分離培養(yǎng)出兔角膜內(nèi)皮細胞。原代培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)呈多邊形，，表面富含微絨毛，細胞間緊密連接，約10天后可融合形成鋪路石樣的外觀。分離培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細胞能夠表達內(nèi)皮細胞的蛋白標志物ZO-1和NSE。 結論：通過后彈力層揭除聯(lián)合胰酶消化法可成功分離培養(yǎng)出兔角膜內(nèi)皮細胞，且其具有角膜內(nèi)皮細胞所固有的特性。 第三部分：共培養(yǎng)體系下誘導臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜內(nèi)皮樣細胞分化的初步實驗研究 目的：通過與兔角膜內(nèi)皮細胞行體外共培養(yǎng)，觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞是否能向角膜內(nèi)皮樣細胞誘導分化。 方法：利用Transwell共培養(yǎng)體系，將人臍帶間充質(zhì)干細胞與兔角膜內(nèi)皮細胞進行共培養(yǎng)，誘導分化7天后的細胞行倒置顯微鏡和原子力顯微鏡下觀察形態(tài)。CCK-8檢測誘導分化細胞的增殖活性，實時熒光定量PCR和Western blot檢測誘導分化細胞的相關內(nèi)皮細胞的標志物蛋白（緊密連接蛋白、神經(jīng)鈣黏素和神經(jīng)元特異性烯醇化酶）及特異性轉(zhuǎn)錄因子（FoxC1和Pitx2）的表達情況。 結果：共培養(yǎng)誘導分化后細胞的增殖、周期及凋亡與誘導前相比無明顯差異。與兔角膜內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)7天后，紡錘形的臍帶間充質(zhì)干細胞已逐漸向卵圓形和多角形的細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，且能夠表達內(nèi)皮細胞相對特異性的標志物蛋白（ZO-1、N-cadherin和NSE）及相關轉(zhuǎn)錄因子（FoxC1和Pitx2）。 結論：通過與兔角膜內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后，人臍帶間充質(zhì)干細胞可被誘導分化為角膜內(nèi)皮樣細胞。
【關鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細胞 角膜內(nèi)皮細胞 組織工程 人工角膜
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R77
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 目錄10-12
• 前言12-18
• 第一部分：人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定18-31
• 引言18-19
• 材料與方法19-24
• 結果24-28
• 討論28-31
• 第二部分：兔角膜內(nèi)皮細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定31-43
• 引言31-32
• 材料與方法32-37
• 結果37-40
• 討論40-43
• 第三部分：共培養(yǎng)體系下誘導臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜內(nèi)皮樣細胞分化的初步實驗研究43-62
• 引言43-44
• 材料與方法44-54
• 結果54-59
• 討論59-62
• 參考文獻62-77
• 全文總結77-78
• 問題和展望78-79
• 主要英文名詞縮略表79-81
• 在校期間發(fā)表的論文及科研成果81-83
• 致謝83

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2 ;堿性成纖維細胞生長因子與不同來源間充質(zhì)干細胞的調(diào)控[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年45期

3 李志勇;郭子寬;郭志坤;;釋放膜微粒:間充質(zhì)干細胞治療的新機制[J];組織工程與重建外科雜志;2012年03期

4 王佃亮;馬萍;王烈明;雷寧;吳誠;;間充質(zhì)干細胞過濾分離器的研制[J];醫(yī)療衛(wèi)生裝備;2013年08期

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6 呼瑩,王秋英,馬麗,馬冠杰,姜學英,趙春華;胰腺源間充質(zhì)干細胞的分離與鑒定[J];中國醫(yī)學科學院學報;2002年01期

7 王勁,羅成基,郭朝華,張勇;間充質(zhì)干細胞與相關因子[J];中國實驗血液學雜志;2002年05期

8 許琴,朱依純,肖雁冰,田虹;小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離及培養(yǎng)[J];遵義醫(yī)學院學報;2002年02期

9 馬麗,呼瑩,馬冠杰,姜學英,趙春華;小鼠真皮間充質(zhì)干細胞的生物學特性及促進造血恢復的研究[J];中華血液學雜志;2003年06期

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1 李艷菊;胡亮杉;郭坤元;;間充質(zhì)干細胞對衰老大鼠睪丸的影響[A];第12屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2009年

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4 馬麗;呼瑩;馬冠杰;姜學英;趙春華;;小鼠真皮間充質(zhì)干細胞的生物學特性及對造血恢復的影響[A];第九屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2003年

5 韓欽;劉艷寧;何東南;閆曦;曹瑩;趙春華;;分離和鑒定小腸上皮干細胞及其可塑性與間充質(zhì)干細胞的比較[A];第10屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2005年

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9 陳廣華;楊婷;付t$t$;苗瞄;金正明;唐曉文;韓悅;何廣勝;仇慧英;馬驍;陳峰;薛勝利;王熒;孫愛寧;吳德沛;;臍帶間充質(zhì)干細胞治療糖皮質(zhì)激素耐藥的難治性急性移植物抗宿主病19例分析[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

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1 滿學杰;天津濱海新區(qū)建最大間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)基地[N];新華每日電訊;2008年

2 滿學杰;津昂賽打造間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)基地[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2008年

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1 陳亮;胰島素樣生長因子1增強骨形態(tài)形成蛋白9介導的間充質(zhì)干細胞成骨分化及成骨作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

2 鄭宗梅;脂肪間充質(zhì)干細胞作為骨組織工程種子細胞的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2006年

3 王憲英;腦組織微環(huán)境及神經(jīng)甾體對臍帶間充質(zhì)干細胞分化的影響[D];河北醫(yī)科大學;2012年

4 李曉東;牙胚間充質(zhì)干細胞在不同條件下牙向分化的實驗研究[D];四川大學;2004年

5 郭虹;胎兒多種組織間充質(zhì)干細胞生物學特征及胎兒骨髓血液血管干細胞特性的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2003年

6 侯靜;間充質(zhì)干細胞在輻射損傷后干性維持的機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

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1 王敏;羊膜間充質(zhì)干細胞克隆的分離和生物學特性的研究[D];華東理工大學;2010年

2 蘇曉華;牛胎肝間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性研究[D];東北林業(yè)大學;2011年

3 鄧長卿;臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性及功能研究[D];蘇州大學;2011年

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6 那仁格日勒;溶血磷脂酸抑制人臍帶間充質(zhì)干細胞凋亡及其分子機理[D];內(nèi)蒙古大學;2013年

7 王黎明;臍帶間充質(zhì)干細胞的分泌蛋白表達譜研究[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

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  本文關鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細胞向角膜內(nèi)皮樣細胞分化的初步實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：342763