【摘要】：白內(nèi)障,定義為全部或部分眼睛的晶狀體混濁,可分為兩大類：先天性和年齡相關性白內(nèi)障。先天性白內(nèi)障的患病率估計為每萬新生嬰兒中2.2-2.5例,其中約50%可遺傳。同白內(nèi)障相關的晶狀體蛋白基因突變發(fā)生在所有三個晶狀體蛋白家族中(α-,β-和γ-晶狀體蛋白),并顯示為不同的表型。目前,至少有60例遺傳性白內(nèi)障己被記錄在案,均由單基因突變引起,相應突變氨基酸也被確定。有些人源γD-晶狀體蛋白(HGD)突變體同先天性白內(nèi)障有著密切聯(lián)系,但是詳細的突變相關性白內(nèi)障形成的分子機制尚不明確。 基于HGD涉及到蛋白質(zhì)沉淀疾病,即白內(nèi)障的形成,本論文以HGD為對象,研究三種HGD的突變體W42R, R76S和P23T的結(jié)構(gòu),折疊以及組裝,探究該晶狀體結(jié)構(gòu)與功能之間的關系,進而闡明白內(nèi)障形成的結(jié)構(gòu)基礎。 (1)部分去折疊HGD的中間體,可能使蛋白質(zhì)聚集沉淀并最終導致晶狀體的模糊,人源γD晶狀體蛋白突變體同遺傳性白內(nèi)障的形成具有緊密的聯(lián)系。來源于中國人家庭與白內(nèi)障相關的γD晶狀體蛋白突變體(W42R),表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,突變體蛋白較HGD溶解性大大下降。我們解析了W42R突變體的晶體結(jié)構(gòu),分辨率1.7A,同HGD的晶體結(jié)構(gòu)相比較只發(fā)現(xiàn)了微小的變化。令人感興趣的是,W42R突變體蛋白酶水解非常敏感,表明小量部分去折疊成分的存在；核磁共振波譜實驗證實并定量分析了部分去折疊成分的存在；氫/氘交換實驗也揭示了部分去折疊成分同天然折疊成分之間的化學交換,只是W42R突變體的交換速度及其緩慢。同時,HGD的紫外線輻射實驗,導致了蛋白分子N端區(qū)域的損傷,輻射后的蛋白對蛋白酶具有同W42R突變體相似的敏感性。所有的實驗數(shù)據(jù)允許我們建立一個基于W42R致病機理的模型,即W42R突變體致病機理可以作為光損傷和年齡相關白內(nèi)障的代表。 (2)R76S是一個從一個印度家庭新發(fā)現(xiàn)的與遺傳性白內(nèi)障相關的HGD突變體,我們在大腸桿菌中表達了該突變體蛋白,通過圓二色,熒光以及NMR確定了蛋白熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性。出乎意料的是,R76S突變體,除了擁有較低的等電點外,在生物物理和生物化學性質(zhì)方面同HGD并無明顯不同,通過NMR確定的R76S突變體的液體結(jié)構(gòu),包括殘余偶極耦合(Resicual Dipoie Couplings, RDCs),弛豫測定,表面其與突變體具有近似相同的液體結(jié)構(gòu)。同時,變性/復性動力學實驗表明無論R76S突變體還是野生型突變體都顯示了類似的被αB-晶狀體蛋白抑制的經(jīng)由錯誤折疊途徑產(chǎn)生的沉淀。綜上所述,研究結(jié)果表明結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化都不是R76S突變體導致白內(nèi)障產(chǎn)生的原因,但是,等電點的改變和相關表面電位的變化或者氨基酸殘基天然性質(zhì)的變化極有可能影響到R76S突變體與晶狀體中其他蛋白家族的相互作用。 (3)與白內(nèi)障相關的HGD P23T突變體具有地理上廣泛分布和表型多樣的特性。23位氨基酸殘基的突變極大的降低了蛋白質(zhì)本身的溶解性。由于缺乏P23T突變體的X-ray晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),在分子水平上對突變體本身的理解并不充分。本論文工作首次成功解析了P23T突變體的晶體結(jié)構(gòu),P23T突變體采用P21的結(jié)晶群,每個不對稱單元包含兩個蛋白質(zhì)分子。同野生型HGD相比,除了一些細微的差別,P23T突變體結(jié)構(gòu)基本保持不變。這些細微差別包括：Trp42的側(cè)鏈與不同的氨基酸殘基形成了新的氫鍵,結(jié)果發(fā)生了小角度的轉(zhuǎn)向；同時我們計算P23T突變體和HGD的溶液可接觸表面積(SASA),結(jié)果并無明顯差異。有報道表明P23T突變體溶解度表現(xiàn)為溫度退行性(隨溫度的增加溶解度降低)。在我們的研究中,P23T突變體的溶解度顯示出離子強度依賴性,發(fā)現(xiàn)在NaCl的存在下P23T突變體的沉淀聚集被部分抑制。綜上所述,研究結(jié)果表明結(jié)構(gòu)的變化并不是P23T突變體導致白內(nèi)障產(chǎn)生的原因,但是Thr取代Pro確實改變了蛋白質(zhì)分子間的相互作用。 綜上所述,論文研究表征了W42R突變體的結(jié)構(gòu)特點并揭示了其同年齡相關白內(nèi)障之間的聯(lián)系；排除了R76S突變由于自身蛋白-蛋白相互作用導致白內(nèi)障的可能性；首次解析了P23T突變體的晶體結(jié)構(gòu)。實驗數(shù)據(jù)表明突變帶來的HGD主要空間構(gòu)象上的變化對白內(nèi)障的發(fā)生并不是必要的；但是,突變確實改變了蛋白質(zhì)分子在溶液中的特性,即不同突變體的變性／復性動力學,在白內(nèi)障形成中扮演了至關重要的角色。
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R776.1

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本文編號：2573512