【摘要】： 目的: 本研究擬通過體外壓力培養(yǎng)平臺,分析不同壓力梯度下角膜內(nèi)皮細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點,以及其生物學功能的變化規(guī)律。探討正常眼壓對角膜內(nèi)皮細胞活性的正向調(diào)節(jié)作用,為建立旨在提高角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)質(zhì)量的三維仿生培養(yǎng)系統(tǒng)提供理論依據(jù);闡明病理性高眼壓下角膜內(nèi)皮細胞損傷的病理基礎(chǔ)和調(diào)控環(huán)節(jié),為青光眼治療策略中的內(nèi)皮細胞保護提供實驗依據(jù)。 方法: 第一部分角膜內(nèi)皮細胞體外常規(guī)培養(yǎng) 將帶有兔角膜內(nèi)皮細胞的后彈力層完整撕下,0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA聯(lián)合酶化,純化的角膜內(nèi)皮細胞進行體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),神經(jīng)元烯醇化酶抗體進行細胞表型鑒定, HE染色觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),分析培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞的活性與純度。 第二部分角膜內(nèi)皮細胞正常壓力仿生培養(yǎng) 設(shè)計并制作自動充壓范圍為0～75mmHg的壓力維持培養(yǎng)裝置,測定預(yù)設(shè)壓力的維持時間,確定自動充壓的時間點。將接種了傳代角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)板放入壓力預(yù)設(shè)為2KP的壓力維持培養(yǎng)裝置中,進行持續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡定期觀察細胞形態(tài)及生長規(guī)律, HE染色及掃描和透射電鏡分析細胞結(jié)構(gòu)的變化,茜素紅-臺盼蘭聯(lián)合染色和AnnexiV-PI流式細胞術(shù)分析細胞活性。 第三部分高眼壓對角膜內(nèi)皮細胞損傷機制的研究 通過體外仿生培養(yǎng)系統(tǒng),模擬臨床青光眼的病理過程,將壓力分為壓力急性增高組(50mmHg)、壓力慢性增高組(30mmHg)、波動組(15mmHg~25 mmHg ~20 mmHg ~10 mmHg)、正常壓力組(15mmHg)作為對照組。倒置顯微鏡定期觀察細胞形態(tài)及生長規(guī)律, HE染色分析細胞結(jié)構(gòu)的變化,茜素紅-臺盼蘭聯(lián)合染色和AnnexiV-PI流式細胞術(shù)分析細胞活性, RT-PCR分析Fas/FasL在壓力作用下的表達規(guī)律,Western-blotting檢測不同壓力組凋亡相關(guān)蛋白BcL-2和P53的時空量化曲線,免疫熒光觀察凋亡啟動后細胞內(nèi)Cytc的表達強度及范圍。 結(jié)果: 1、后彈力層撕除聯(lián)合酶消化法獲得大量純化的角膜內(nèi)皮細胞,快速貼壁生長并增殖,體外培養(yǎng)3～4 d即融合成單層細胞,表達神經(jīng)元烯醇化酶抗體陽性, HE染色及活性染色提示細胞功能良好。 2、生理壓力環(huán)境培養(yǎng)下的角膜內(nèi)皮細胞生長活性良好,細胞立體感強、外形扁平呈六邊形,細胞間連接緊密,更接近機體生理狀態(tài)下生長的內(nèi)皮細胞。生理壓力下未見明顯的細胞凋亡現(xiàn)象。 3、高壓環(huán)境下培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞,增殖緩慢,胞體大而透明,胞漿內(nèi)含較多的顆粒,細胞間隙增寬。隨壓力越高,培養(yǎng)時間的增長, AnniexV表達增強,凋亡細胞比例顯著增加。 4、RT-PCR未檢測到Fas/Fasl的表達,高壓持續(xù)作用下凋亡相關(guān)蛋白P53的表達顯著上調(diào),Bcl-2表達則隨之下降,使用抑制劑預(yù)處理的細胞,其蛋白P53的表達較未預(yù)處理的細胞明顯下降,Bcl-2表達明顯增加。高壓組角膜內(nèi)皮細胞胞漿中Cytc的陽性表達顯著增加。 結(jié)論: 1.正常壓力仿生培養(yǎng)環(huán)境,對角膜內(nèi)皮細胞的功能有正向調(diào)節(jié)作用,誘導角膜內(nèi)皮細胞骨架的改變,使其物理形態(tài)更接近體內(nèi)的角膜內(nèi)皮細胞,同時促進體外培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細胞之間連接功能的建立,為工程化角膜內(nèi)皮移植膜的構(gòu)建提供了新的環(huán)境模式誘導平臺。 2.眼壓的波動性與角膜內(nèi)皮細胞的損傷之間存在相關(guān)性,高壓力對角膜內(nèi)皮細胞有損傷作用,導致細胞凋亡的發(fā)生,并且呈現(xiàn)時間-量效曲線。 3.壓力調(diào)控下細胞凋亡啟動途徑是角膜內(nèi)皮細胞Cytc從線粒體釋放入胞漿,通過激活凋亡的內(nèi)源性途徑實現(xiàn)。 4. Caspase9可以作為青光眼高眼壓對角膜內(nèi)皮細胞損傷的藥物干預(yù)靶點,為青光眼治療策略中的內(nèi)皮細胞保護提供實驗依據(jù)。
【圖文】：

立體感強，周圍有后彈力層碎片。24h 后見大部分細胞已經(jīng)貼壁，細胞形態(tài)不規(guī)則多角，胞漿豐富，核不明顯，將后彈力層碎片吸出。第 2-3d 細胞生長活躍向四周擴展，形態(tài)不歸則�？梢姴糠旨毎诤闲纬杉毎麔u（如圖 2-2）。第4d 見大部分細胞融合，細胞多呈多邊形，邊界清楚，胞漿豐富，，核不明顯，呈鋪路石狀，面積已達孔底的 80%-90% （如圖 2-3 ）2.3.1.2 傳代培養(yǎng)原代 RCE 接種在培養(yǎng)板內(nèi) 3～4h 后部分開始貼壁,24h 后大部分細胞已經(jīng)貼壁，角膜內(nèi)皮細胞胞體飽滿,胞漿豐富,形態(tài)不規(guī)則,以多邊行為主，細胞生長與分裂十分旺盛，3～4d 細胞達密集狀態(tài)（如圖 2-4）。細胞傳至 4-5 代后,細胞開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，細胞胞體透明度增加,胞體增大，隱約可見細胞胞核,細胞內(nèi)顆粒增多，（如圖 2-5）2.3.2 RCEC 的免疫學鑒定神經(jīng)元烯醇化酶抗體表達陽性，細胞胞漿表現(xiàn)為棕黃色，細胞核呈藍色，無角膜上皮細胞及基質(zhì)細胞污染（如圖 2-6）

立體感強，周圍有后彈力層碎片。24h 后見大部分細胞已經(jīng)貼壁，細胞形態(tài)不規(guī)則多角，胞漿豐富，核不明顯，將后彈力層碎片吸出。第 2-3d 細胞生長活躍向四周擴展，形態(tài)不歸則�？梢姴糠旨毎诤闲纬杉毎麔u（如圖 2-2）。第4d 見大部分細胞融合，細胞多呈多邊形，邊界清楚，胞漿豐富，核不明顯，呈鋪路石狀，面積已達孔底的 80%-90% （如圖 2-3 ）2.3.1.2 傳代培養(yǎng)原代 RCE 接種在培養(yǎng)板內(nèi) 3～4h 后部分開始貼壁,24h 后大部分細胞已經(jīng)貼壁，角膜內(nèi)皮細胞胞體飽滿,胞漿豐富,形態(tài)不規(guī)則,以多邊行為主，細胞生長與分裂十分旺盛，3～4d 細胞達密集狀態(tài)（如圖 2-4）。細胞傳至 4-5 代后,細胞開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，細胞胞體透明度增加,胞體增大，隱約可見細胞胞核,細胞內(nèi)顆粒增多，（如圖 2-5）2.3.2 RCEC 的免疫學鑒定神經(jīng)元烯醇化酶抗體表達陽性，細胞胞漿表現(xiàn)為棕黃色，細胞核呈藍色，無角膜上皮細胞及基質(zhì)細胞污染（如圖 2-6）
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R772.21

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本文編號：2573367