【摘要】：鼻咽癌是起源于鼻咽上皮細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率具有明顯的地域分布特征，在東南亞地區(qū)和中國南方有極高的發(fā)病率，年發(fā)病率為20~30/10萬。根據(jù)國際癌癥研究署的全球惡性腫瘤的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2008年新發(fā)鼻咽癌病人超過84,000人，其中80%在亞洲，5%在歐洲。病因學研究顯示鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染、種族背景、飲食習慣、喝酒和環(huán)境因素相關�，F(xiàn)在，隨著影像診斷、放療技術的進步和聯(lián)合放化療的應用，使鼻咽癌局部病灶得到更好的控制。然而，多數(shù)鼻咽癌患者在初次診斷時已為晚期，其治療效果還不盡如人意，III期和IV期患者的5年生存率分別為53%~80%、28%~61%。因此，努力更好地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的特異性治療靶點，在鼻咽癌早期診斷、個體化治療治療、預后中顯得尤為重要。 Calpain是Ca2+依賴的半胱氨酸蛋白水解酶家族。至今，在人類已鑒定14個家族成員，大部分成員與細胞粘附相關，參與細胞的伸展、遷移、增殖、細胞周期的的調控和凋亡等。Capn4（又稱為Capn4S1）是calpain蛋白的一個小分子調節(jié)亞基，在調節(jié)calpain的穩(wěn)定性和活性中發(fā)揮著至關重要的作用。多項研究表明Capn4的缺失引起calpain-1和calpain-2功能障礙。在轉基因小鼠中的研究顯示敲除Capn4基因可顯著降低calpain活性，從而影響小鼠的正常發(fā)育，導致胚胎早期死亡；Knockdown Capn4降低成纖維細胞的遷移和粘附能力。最近的研究報道Capn4在肝細胞癌和肝內膽管上皮細胞癌中高表達，而且Capn4表達程度與患者的預后密切相關。干擾Capn4的表達能夠顯著降低肝細胞癌和肝內膽管上皮細胞癌的細胞侵襲和遷移能力。由此，推測Capn4在轉移癌的細胞遷移和粘附中發(fā)揮一定的作用，其在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮類似的作用尚不清楚。 【目的】 1、研究Capn4在鼻咽癌中的表達情況，及與臨床病理學特征的關系；2、探討Capn4在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在的分子機制。 【方法】 1、分別應用RT-PCR和Western-blot方法檢測Capn4在新鮮活檢鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞系中的mRNA和蛋白表達水平；2、免疫組化分析Capn4在鼻咽癌組織中的表達及統(tǒng)計學分析其與臨床病理學特征的關系；3、構建Capn4siRNA，應用transwell實驗和裸鼠尾靜脈注射轉移實驗分析Capn4對鼻咽癌細胞系5-8F、CNE2體內外侵襲和轉移能力的影響；4、Western blot分析Capn4對轉移相關基因表達的影響；6、分別應用RT-PCR和明膠酶譜法分析MMP2的mRNA表達情況和酶活性；7、上調、下調MMP2的表達，transwell實驗觀察MMP2對Capn4調節(jié)鼻咽癌細胞侵襲轉移的影響；8、Western blot分析NF-κB p65的磷酸化情況；9、細胞增殖實驗、平板克隆實驗、裸鼠體內成瘤實驗分析Capn4對鼻咽癌細胞在體內外增殖能力的影響；10、流式細胞儀分析Capn4對鼻咽癌細胞周期的影響；11、Western blot分析Capn4對細胞周期相關調控蛋白的影響。 【結果】 1、Capn4在鼻咽癌組織中的表達顯著高于正常鼻咽組織 無論是在mRNA水平還是在蛋白水平，新鮮細針穿刺活檢鼻咽癌組織（7例）中的Capn4表達要明顯高于正常鼻咽組織（2例）。同樣，Capn4在鼻咽癌細胞系5-8F,、CNE2、6-10B的表達明顯高于永生化的正常鼻咽上皮細胞系NP69。我們進一步擴大樣本量收集了183例的石蠟組織，其中153例鼻咽癌組織，30例非癌鼻咽組織，應用免疫組化進行檢測分析。結果顯示Capn4在鼻咽癌組織中的表達高于非癌鼻咽組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P㩳0.001)。統(tǒng)計分析結果顯示Capn4的表達強度與EB病毒感染、鼻咽癌組織的浸潤深度、分化程度、TNM分期及是否發(fā)生遠處轉移、淋巴結轉移相關。即EB病毒感染者Capn4陽性表達率高于無EB病毒感染；腫瘤分化程度越高，Capn4的陽性表達率越低；腫瘤分期越晚，Capn4的陽性表達率越高；出現(xiàn)遠處及淋巴結轉移的陽性表達率要明顯高于未轉移的，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Kaplan Meier生存期分析顯示Capn4在鼻咽癌中表達的程度與鼻咽癌患者的預后密切相關，Capn4高表達的患者總生存期、無進展生存期均低于低表達者(P=0.002, P=0.003)。 2、下調Capn4的表達能夠在體內外降低鼻咽癌細胞的轉移、侵襲能力 我們成功構建了兩對Capn4小干擾RNA (Capn4/siRNA-1andCapn4/siRNA-2)，穩(wěn)定轉染5-8F、CNE2鼻咽癌細胞系。RT-PCR和Western blot分析顯示與對照細胞相比，轉染Capn4/siRNA-1、 Capn4/siRNA-2的細胞內Capn4mRNA和蛋白表達水平均明顯降低。Transwell和裸鼠體內轉移實驗在體內外證實轉染Capn4/siRNA細胞的轉移、侵襲能力顯著低于對照細胞，結果顯示：對照組出現(xiàn)7/10例肝肺轉移，而注射轉染Capn4/siRNA細胞的裸鼠只出現(xiàn)1/10的肝轉移和2/10例的肺轉移。 3、Capn4通過上調MMP2的表達促進鼻咽癌細胞的轉移 為深入研究Capn4調節(jié)鼻咽癌細胞轉移、侵襲的分子機制，Western blot結果表明siRNA下調Capn4的表達能夠引起MMP2、Snail和Vimentin的低表達，E-cadherin的高表達，但對MMP9、N-cadherin和β-catenin的表達沒有影響。RT-PCR進一步證實轉染Capn4/siRNA能引起鼻咽癌細胞內MMP2mRNA表達的下調；明膠酶譜檢測MMP2的酶活性也顯示在5-8F、CNE2兩個細胞系內下調Capn4的表達均能引起MMP2酶活性的降低。為了確定Capn4是否是通過誘導MMP2的表達來調節(jié)鼻咽癌細胞的遷移和侵襲，我們首先應用siRNA技術下調鼻咽癌細胞系MMP2的表達，然后觀察細胞的遷移和侵襲能力，實驗結果顯示：下調MMP2的表達能引起5-8F、CNE2細胞的遷移和侵襲能力下降，且其下降程度與siRNACapn4細胞相似，差異無統(tǒng)計學意義。最后我們在抑制鼻咽癌細胞內Capn4表達的基礎上，過表達MMP2的表達，觀察細胞的遷移和侵襲能力，結果顯示：在5-8F、CNE2細胞系中外源性過表達MMP2后均能夠恢復siRNACapn4所引起的細胞遷移和侵襲能力的下降。 4、Capn4調節(jié)MMP2的表達是通過NF-κB的活化 有研究報道在肝細胞癌中NF-κB是Capn4促細胞轉移的下游效應分子，，此外，在即往的多個研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB能夠上調MMP2的表達來促進腫瘤細胞的轉移。因此，我們就設想Capn4在鼻咽癌細胞系中上調MMP2的表達是否也是通過活化NF-κB來完成的。Western blotting分析顯示siRNA下調Capn4的表達后能顯著降低細胞內NF-κB p65的磷酸化；相反，外源性的過表達Capn4后能增加細胞內NF-κB p65的磷酸化。最后我們應用NF-κB抑制劑helenalin抑制NF-κB的活性，觀察細胞內MMP2的表達變化，結果顯示不管是過表達Capn4還是knockdownCapn4，細胞在應用helenalin抑制劑后，細胞內MMP2的表達水平與對照細胞相比，均有明顯的下降，該結果表明抑制NF-κB的活性能夠抑制Capn4對MMP2表達的誘導。 5、體內外實驗證實Capn4促進鼻咽癌細胞的增殖 Western blot分析顯示與親本細胞及對照細胞相比，5-8F/siRNA、CNE2/siRNA細胞內的細胞增殖標志PCNA蛋白的表達明顯降低。緊接著，我們應用CCK8實驗進一步觀察Capn4對鼻咽癌細胞體外增殖能力的影響，下調Capn4的表達可使鼻咽癌細胞5-8F、CNE2生長能力下降，與親本細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。平板克隆實驗結果同樣顯示：與轉染空載體的對照細胞系相比，轉染小干擾RNA的5-8F、CNE2細胞其克隆形成數(shù)明顯下降(P 0.05)。我們進一步觀察下調Capn4的表達對鼻咽癌細胞裸鼠體內成瘤的影響，與注射轉染空載體5-8F/Control細胞相比，注射5-8F/siRNA1細胞的裸鼠體內腫瘤增長相對緩慢，腫瘤體積明顯小于對照組（P＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。提取裸鼠體內移植瘤的蛋白組織行Western-blot分析，結果顯示：第六周時，轉染小干擾RNA在體內仍可有效地抑制細胞內Capn4的表達。 6、抑制Capn4的表達能夠阻滯鼻咽癌細胞周期進展 為進一步探討Capn4促進鼻咽癌細胞增殖的分子機制，我們應用流式細胞術檢測細胞DNA的含量，結果顯示：與對照5-8F/Control細胞（51.2±1.1%）相比，穩(wěn)定轉染Capn4/siRNA1和Capn4/siRNA2的鼻咽癌細胞5-8F G1期DNA含量（68.5±1.7%；60.7±1.3%）明顯增加，S期DNA含量明顯減少，P＜0.05。為了進一步觀察Capn4影響鼻咽癌細胞的增殖能力，是否是通過調節(jié)細胞周期相關調控分子的表達。我們應用Western blot檢測了細胞周期相關分子CyclinD1、CyclinD2、CyclinE、CDK2、CDK4、P27、P57、P21的表達情況，結果顯示：下調Capn4的表達，引起CyclinD1、CyclinD2、CyclinE的表達降低和P27表達的增多，而CDK2、CDK4、P57、P21的表達沒有變化。 【結論】 1、Capn4在鼻咽癌組織中的表達要顯著高于正常鼻咽組織，Capn4在鼻咽癌組織中的表達水平與EB病毒的感染、組織的分化程度、TNM分期、腫瘤的體積以及是否出現(xiàn)淋巴結和遠處轉移呈正相關；2、用小干擾RNA下調Capn4的表達可以明顯抑制鼻咽癌細胞轉移、侵襲、增殖和成瘤能力；3、Capn4促進鼻咽癌細胞的轉移、侵襲，可能是依賴NF-κB信號通路上調MMP2的表達來實現(xiàn)；4、抑制Capn4的表達可以阻止鼻咽癌細胞由G1期向S期進展，使細胞停滯于G0/1期，其潛在的機制可能是部分通過下調Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin E，上調p27來實現(xiàn)。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2571202