【摘要】：應(yīng)用抑制性消減雜交和差異篩選法,并結(jié)合生物信息學(xué)的分析,克隆到鼻咽癌組織中表達下調(diào)的新基因LBH。前期轉(zhuǎn)基因研究證實LBH基因表達能抑制鼻咽癌細胞的增殖,初步確定其功能與抑制細胞周期進展有關(guān)。為進一步明確LBH基因的作用及機制,本課題以正常鼻咽上皮細胞NP69為模型,采用基因沉默技術(shù)探討LBH基因沉默對細胞周期的影響及相應(yīng)的分子機制。 目的: 以LBH基因正常表達的人鼻咽上皮細胞NP69為模型,通過基因沉默技術(shù)使LBH表達下調(diào),闡明LBH基因沉默調(diào)控細胞周期的分子機制。 方法: 1.設(shè)計、合成實驗組和對照組小分子干擾RNA(siRNA),轉(zhuǎn)染NP69細胞,使LBH基因沉默,采用Real-Time quantitative PCR技術(shù)檢測不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染后LBH基因表達,優(yōu)化獲得LBH基因沉默最佳效果的條件; 2.利用流式細胞術(shù)(Flow cytometry)檢測LBH基因沉默對NP69細胞周期的影響; 3.通過Real-Time quantitative PCR、Western Blot技術(shù)檢測細胞周期相關(guān)基因mRNA及蛋白表達,初步確定LBH基因沉默對細胞周期調(diào)控的分子機制; 4.進一步采用雙報道系統(tǒng)探討LBH基因沉默對NF-κB和Cyclin D1轉(zhuǎn)錄活性的影響,從而研究細胞周期相關(guān)基因調(diào)控機理。 結(jié)果: 1.通過對LBH基因表達水平的檢測,相對對照組,30nM siRNA轉(zhuǎn)染NP69細胞48h后即可獲得最好的LBH基因沉默效果,沉默效率達到91%; 2.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:對照組中G1期和S期的細胞分別占總細胞數(shù)的49.94%和49.75%,LBH基因沉默組中G1期和S期細胞的比例分別為44.40%和54.17%,表現(xiàn)為G1減少及S期增加的特點; 3. NP69細胞中Cyclin E2基因在LBH-siRNA轉(zhuǎn)染48h后,其相對表達量相對對照組上調(diào)95%,Cyclin E1基因相對表達量無明顯變化; 4. Western檢測結(jié)果顯示:LBH-siRNA轉(zhuǎn)染組中c-Myc、Cyclin E2、p-Rb、Rb蛋白表達上調(diào),而Cdc25A蛋白表達無明顯差別; 5.熒光素酶測定表明:LBH-siRNA轉(zhuǎn)染48h和72h后,NF-κB轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)上調(diào)358%和230%,Cyclin D1轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)上調(diào)407%和349%。 結(jié)論: 1.靶向于LBH基因的LBH-siRNA能有效沉默NP69細胞中LBH基因的表達; LBH基因沉默通過上調(diào)細胞周期G1-S期R點的一個關(guān)鍵的周期蛋白Cyclin E2表達促進了NP69細胞G1-S期的進展。LBH基因沉默后,c-Myc、P-Rb、Rb蛋白表達上調(diào),而Cdc25A蛋白表達無變化,由此推測LBH基因沉默通過C-Myc上調(diào)Cyclin E2的表達,進而激活下游效應(yīng)分子P-Rb、Rb,最終促進NP69細胞周期G1-S期進展,Cdc25A可能沒有參與c-Myc對Cyclin E2的調(diào)控。 2. LBH基因沉默通過上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,從而上調(diào)C-Myc,Cyclin D1最終促進G1-S期細胞周期的進展。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2564067