【摘要】：角膜是位于眼睛最前方的透明組織，是行使眼屈光功能的重要組成部分。當角膜受到來自微生物、機械力、化學物和熱力等作用造成損傷時，易引發(fā)各種角膜疾病，造成角膜混濁，輕者影響視力，重者甚至致盲。角膜的深度燙傷、化學灼傷及機械劃傷不僅會導致上皮層的功能缺失，還會造成深度的基質(zhì)創(chuàng)傷，需要進行移植以替代受損的上皮-基質(zhì)部分。行穿透性角膜移植對角膜創(chuàng)傷較大，術后引發(fā)免疫排斥和新生血管的風險比板層移植要高，且角膜內(nèi)皮層并沒有損傷，行板層移植可以保留原內(nèi)皮層和部分基質(zhì)，但需要分別進行兩次移植手術以分別替換受損基質(zhì)和上皮，可是多次創(chuàng)傷修復也容易導致新生血管，影響手術預期的效果。如果能運用組織工程技術重建出組織工程半角膜（角膜上皮-基質(zhì)復合物）（Tissue-engineered human hemicornea, TE-hHC），將會減少二次手術的風險，提高手術移植的效果。另外由于供體材料的缺乏，遠遠不能滿足角膜移植手術的需要，亟需找到一種合適的材料以代替天然角膜，組織工程半角膜將會是合適的半角膜替代物，對滿足角膜前板層移植的需求具有重要意義。 種子細胞和載體支架是體外重建TE-hHC的兩大要素。目前用于組織工程的種子細胞可來源于原代細胞、干細胞及轉(zhuǎn)染的細胞系，用作載體支架的材料包括天然高分子材料和合成高分子材料。但原代細胞數(shù)量少，干細胞的成功誘導還需進一步證實，轉(zhuǎn)染的干細胞存在安全問題，膠原等自然高分子材料降解快、機械強度低，而合成高分子材料生物相容性差。本文采用的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性的HCEP（human corneal epithelium, HCEP）細胞和基質(zhì)（human corneal stroma, HCS）細胞，具有細胞種屬和功能正常，細胞生長分裂旺盛，安全性高等優(yōu)點，作為重建TE-hHC的種子細胞來源。本文利用實驗室業(yè)已建立的脫細胞豬角膜基質(zhì)（acellular porcine corneal stroma, aPCS）制備技術工藝，制備出透明性好，與細胞有較好生物相容性的aPCS，作為體外重建TE-hHC的載體支架。 為了檢驗HCEP細胞和HCS細胞是否適合作為TE-hHC的種子細胞，本文鑒定了這兩種細胞的特征。鑒定結(jié)果顯示：第90代HCEP細胞和第25代HCS細胞分別呈典型的上皮樣細胞形態(tài)和成纖維樣細胞形態(tài)，生長與分裂旺盛，群體倍增時間分別為39.2小時和43.3小時，特征性染色體數(shù)目都仍為46，核型都為（5M+12SM+5ST+Y），二者的G帶帶型也均正常，且裸鼠接種實驗證實二者均沒有致瘤性，前者具有HCEP細胞特異性標志蛋白——角蛋白3、角蛋白12以及細胞連接蛋白ZO-1、E-鈣粘蛋白、間隙連接蛋白-43、整聯(lián)蛋白β1的陽性表達，后者具有HCS細胞特異性標志蛋白——波形蛋白以及細胞連接蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43、功能蛋白——乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵和鈣泵的陽性表達。表明第90代HCEP細胞和第25代HCS細胞的屬性和功能蛋白表達正常，適于用作TE-hHC體外重建的種子細胞。 本文利用本實驗室業(yè)已建立的aPCS制備技術工藝，成功制備出了透明度高、機械性能好、可降解且生物相容性好的aPCS，并選用帶有前彈力層的aPCS作為載體支架、選用屬性和功能蛋白表達正常的第90代HCEP細胞以及第25代HCS細胞為種子細胞，進行了TE-hHC的體外重建研究。首先，采用微量注射的方法將HCS細胞注入aPCS支架材料中，在含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液、37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時；其次，將HCEP細胞接種于aPCS的前彈力層面，換用10%胎牛血清的DMEM/F12（3:1）培養(yǎng)液采用氣-液界面培養(yǎng)方法持續(xù)培養(yǎng)6天，獲得TE-hHC；最后，并利用光鏡觀察、石蠟切片HE染色、茜素紅染色、免疫組織熒光、掃描電鏡和透射電鏡等方法對重建所得TE-hHC的形態(tài)結(jié)構和細胞功能蛋白表達等進行了鑒定。TE-hHC的體外重建及其鑒定結(jié)果顯示，TE-hHC透明度較高，aPCS支架內(nèi)基質(zhì)細胞伸展良好，與支架材料結(jié)合緊密；aPCS支架表面形成6~7層的復層上皮結(jié)構，表層細胞連接緊密，表面有豐富的微絨毛結(jié)構，整個上皮層細胞之間以及細胞與aPCS之間均形成了細胞連接結(jié)構，與正常半角膜的結(jié)構相近；TE-hHC的HCEP細胞和HCS細胞的特征性蛋白、功能蛋白表達均呈陽性，與正常細胞的表型和功能相同。上述結(jié)果顯示，本文以帶有前彈力層的aPCS為載體支架、以第90代HCEP細胞以及第25代HCS細胞為種子細胞體外重建的TE-hHC，具有與活體角膜相似的組織結(jié)構，其種子細胞并具有功能蛋白的陽性表達，表明其可能具有半角膜的生物學功能。 為了鑒定體外重建TE-hHC的生物學功能，，本文選用比格犬和獼猴進行了TE-hHC的前板層移植實驗，并通過過裂隙燈顯微鏡觀察、角膜測厚測壓等方法來評估在體TE-hHC的透明度、厚度和新生血管等特征。比格犬移植實驗結(jié)果顯示，在術后前期，植片水腫和炎癥反應比較嚴重，角鞏邊際處形成新生血管叢，縫線處新生血管聚集，角膜表面粗糙，角膜不夠透明；但隨著時間推移，角膜水腫、炎癥及新生血管漸漸消失，角膜透明度逐漸增加；第40天后，整個角膜已呈透明狀態(tài)。獼猴移植實驗結(jié)果顯示，在術后前期，植片由一開始的水腫模糊狀態(tài)，逐漸消腫澄清，到第30天與對照眼相比幾乎完全透明；第40天后，植片依舊保持透明，愈合良好。上述動物角膜移植結(jié)果表明，本文體外重建所得TE-hHC在動物角膜中能發(fā)揮出良好的生物學功能，可作為捐獻角膜的替代物用于前板層角膜移植，為角膜前板層深度損傷患者利用TE-hHC移植重見光明創(chuàng)造了條件。 綜上所述，本文以細胞屬性和正常功能的第90代HCEP細胞和第25代HCS細胞為種子細胞，以與這兩種種子細胞具有良好生物相容性的aPCS為載體支架，成功體外重建了形態(tài)結(jié)構和功能屬性與活體半角膜相似的TE-hHC，比格犬和獼猴前板層角膜移植實驗證實其能發(fā)揮良好的生物學功能，有望作為捐獻角膜的等效替代物用于半角膜損傷患者的臨床治療、使患者重見光明成為可能。
【圖文】：

細胞光滑透明，生長狀態(tài)良好（圖2.1B）；繪制的細胞生長曲線顯示，細胞在貼壁后 36 小時基本處于遲緩期，細胞增殖偏慢，第 36~72 小時細胞增殖迅速，處于對數(shù)生長期， 第 72~96 小時處于平穩(wěn)期，第 96 小時以后處于衰亡期，細胞數(shù)量明顯下降（圖 2.2）；根據(jù)公式計算得到的細胞群體倍增時間是 39.2 小時，表明細胞分裂旺盛，狀態(tài)良好。復蘇的 HCS 細胞呈典型成纖維樣形態(tài)，細胞飽滿，成流線型有序排布（圖2.1A）；繪制的細胞生長曲線顯示

體特征 2n=46，5M+12SM+5ST+Y（圖 2.6；圖 2.7A）；G 帶顯示細胞具有典型的人染色體特征（圖 2.7B）。02040608010012014016018020044 45 46 48 50 52 54 56 58染色體數(shù)胞數(shù)細圖 2.4 第 90 代 HCEP 細胞的染色體數(shù)目分布
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R779.65

【參考文獻】

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1 薛霜;獨軍政;趙建勇;高閃電;常惠蕓;;整聯(lián)蛋白結(jié)構與信號轉(zhuǎn)導機制[J];動物醫(yī)學進展;2010年01期

本文編號：2564056