發(fā)布時間：2019-10-03 05:42

【摘要】：胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)可在體外無限增殖,且保持未分化狀態(tài),其在特定環(huán)境下可被誘導分化為各種組織細胞,因此成為人體器官功能喪失后替代治療的理想選擇。目前,對內(nèi)耳毛細胞損傷導致的永久性感音神經(jīng)性耳聾尚無有效的治療方法,為此,國內(nèi)外眾多學者開始探索將ESCs誘導分化為內(nèi)耳細胞并進一步治療耳聾的可行性。本研究旨在初步觀察未經(jīng)體外誘導分化的ESCs導入聽力正常及氨基糖甙類藥物致聾大鼠鼓階后,ESCs在內(nèi)耳的存活、分布及分化情況。 第一部分氨基糖甙類藥物性耳聾大鼠模型的建立 目的:觀察阿米卡星對新生大鼠耳蝸的損傷作用,探討耳蝸毛細胞完全缺失大鼠模型的建立方法。 方法:9天齡wistar乳鼠30只,隨機分成聽力正常對照組(10只)和阿米卡星致聾組(20只)。后者每日一次皮下注射硫酸阿米卡星(500mg/kg),連續(xù)7天。分別于給藥結(jié)束后1周、6周和12周進行短純音聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)測試、耳蝸冰凍切片和掃描電鏡形態(tài)學觀察。 結(jié)果:阿米卡星組20只大鼠全部存活,給藥6周后雙耳各頻率ABR閾值大于95 dBSPL,繼續(xù)觀察至12周聽力無恢復。掃描電鏡和HE染色觀察顯示給藥6周后耳蝸各回內(nèi)、外毛細胞全部喪失。 結(jié)論:中等劑量阿米卡星連續(xù)給藥可致新生大鼠耳蝸毛細胞全部喪失,以及永久性極重度感音神經(jīng)性耳聾,是進行干細胞內(nèi)耳植入治療的理想模型。 第二部分胚胎干細胞內(nèi)耳植入方法研究 目的:探討外源胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)內(nèi)耳導入的有效方法。 方法:5-6周齡Wistar大鼠10只,右耳為實驗耳,經(jīng)鼓階打孔法植入帶有綠色熒光蛋白(EGFP)的ESCs;左耳為對照組,不實施手術。術前1周與術后即刻行ABR檢查,術后36小時取雙側(cè)耳蝸做冰凍切片,觀察ESCs在內(nèi)耳的存活和分布情況。 結(jié)果:導入的ESCs大部分聚集懸浮于鼓階外淋巴中,少數(shù)在鼓階基底膜嵴及外側(cè)壁貼壁生長,柯替器等中階部位未見有ESCs的分布。ABR檢測顯示鼓階打孔途徑導入ESCs可使大鼠聽力下降約10 dB。 結(jié)論:經(jīng)鼓階打孔途徑導入耳蝸的ESCs可存活,該操作對內(nèi)耳損傷小,可作為內(nèi)耳細胞移植的有效方式。 第三部分胚胎干細胞導入藥物致聾大鼠內(nèi)耳后的遷移與分化 目的:探討ESCs在藥物致聾大鼠內(nèi)耳的存活、分布及分化情況。 方法:18只新生Wistar乳鼠隨機分成2組:正常對照組(不給予藥物致聾)8只和藥物致聾組10只,左耳陰性對照,右耳通過鼓階底轉(zhuǎn)打孔途徑導入干細胞。分別于導入ESCs后2周和6周進行內(nèi)耳組織冰凍切片熒光觀察。 結(jié)果:導入2周后,對照組ESCs全部聚集于鼓階內(nèi),藥物致聾組可見少數(shù)外源細胞從鼓階遷移至中階;導入6周后,對照組鼓階、中階均未見存活的ESCs,藥物致聾組在鼓階內(nèi)壁、骨螺旋板、螺旋韌帶、內(nèi)溝細胞、外溝細胞和柯替氏器部位可見ESCs分布,其中部分在柯替氏器部位表達毛細胞標記物myosinⅦa。 結(jié)論:內(nèi)耳損傷的微環(huán)境下,導入內(nèi)耳的ESCs存活期延長,部分由鼓階向中階遷移,少數(shù)可分化為毛細胞前體細胞。
【圖文】：

圖 2：阿米卡星對幼年大鼠耳蝸損傷作用的形態(tài)學觀察A. 正常大鼠耳蝸柯替氏器，內(nèi)、外毛細胞完好；B. 給結(jié)構(gòu)，內(nèi)、外毛細胞缺失，支持細胞、神經(jīng)纖維及螺旋度受損，CO 構(gòu)架尚在；C. 給藥后 6 周 CO 結(jié)構(gòu)基本塌失，，支持細胞明顯損傷并基本消失，SGN 嚴重損傷；D毛細胞和支持細胞完全喪失，整個基底膜為一層扁平上SGN 嚴重缺失。標尺：AB 分別為 20 μm，CD 為 40 μm11

圖 3：阿米卡星對幼年大鼠耳蝸損傷作用的形態(tài)學觀察（掃描電鏡）A. 正常大鼠耳蝸基底膜。I 為內(nèi)毛細胞，呈一字形整齊排列；O 為外毛細胞，呈 V 型排列；P 為支持細胞。B. 給藥 6 周后，基底膜內(nèi)、外毛細胞完全喪失。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R764

【參考文獻】

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本文編號：2545296