【摘要】：內(nèi)耳毛細(xì)胞很容易受藥物、噪音、基因缺陷等因素的影響而受到損傷,導(dǎo)致永久性聽力功能障礙或者前庭功能障礙。毛細(xì)胞受到損傷后,由于哺乳類動物包括人類的毛細(xì)胞自發(fā)修復(fù)和再生能力有限,而導(dǎo)致聽力減退或者前庭功能障礙。激活毛細(xì)胞再生,是治療聽力和前庭功能障礙的有效途徑。而在非哺乳類的脊椎動物如鳥類,在耳毒性藥物或者噪聲損傷后,內(nèi)耳感覺上皮毛細(xì)胞可以通過支持細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)分化,而使毛細(xì)胞自發(fā)再生,最終替代受損的毛細(xì)胞,維持和恢復(fù)感覺上皮的功能。通常認(rèn)為,內(nèi)耳毛細(xì)胞和支持細(xì)胞具有共同的前體細(xì)胞,甚至有研究者認(rèn)為有些支持細(xì)胞是處于某一個特殊分化階段的毛細(xì)胞,當(dāng)受到所處環(huán)境變化如損傷、基因?qū)氲鹊挠绊懞?可以繼續(xù)完成向毛細(xì)胞的分化。因此支持細(xì)胞是目前比較公認(rèn)的再生毛細(xì)胞的前體細(xì)胞。所以,對非哺乳脊椎動物的內(nèi)耳感覺上皮的支持細(xì)胞增殖機(jī)制的研究,有助于進(jìn)一步對哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的研究。生物的細(xì)胞每時每刻都在接受來自細(xì)胞內(nèi)外的各種各樣信號,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生命活動的一種最基本和最重要的方式。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的基因突變或表達(dá)調(diào)控失常、抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的功能等,都將導(dǎo)致細(xì)胞對外界信號反應(yīng)失控,產(chǎn)生疾病。許多疾病(尤其是腫瘤)的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有直接或間接的關(guān)系。很多信號通路都參與并調(diào)控內(nèi)耳的發(fā)育、感覺細(xì)胞的再生等過程;信號通路之間還存在著相互交聯(lián)(crosstalk)作用,相互之間進(jìn)行傳遞和識別,信號分子間相互作用,互相調(diào)控和協(xié)調(diào)著內(nèi)耳感覺上皮上前體細(xì)胞的分裂和毛細(xì)胞的分化。感覺前體細(xì)胞可以分化成毛細(xì)胞或者支持細(xì)胞。研究并闡明相關(guān)信號通路在內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞增殖中的作用和機(jī)制,并調(diào)控在感覺前體細(xì)胞的增殖和分化過程中起著重要作用的相關(guān)信號通路,可以為內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞的再生提供堅實的理論基礎(chǔ),同時為毛細(xì)胞再生提供理想的途徑和方法。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)由Rbl基因編碼,Rb在感覺前體細(xì)胞的細(xì)胞周期和維持早期毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)中起著重要作用。pRb的功能由磷酸化狀態(tài)調(diào)控,pRb可以通過MEK/ERK和Rb/Raf-1兩條信號通路達(dá)到磷酸化。此外,Notch和Wnt信號通路均是高度保守的信號傳導(dǎo)通路,廣泛存在于各種生物體內(nèi)。Notch信號通路是通過局部細(xì)胞間的相互作用控制細(xì)胞命運(yùn)的一種信號通路。Notch信號通路在內(nèi)耳發(fā)育過程中不僅起著側(cè)抑制作用,在早期發(fā)育中還起著誘導(dǎo)增殖分化作用]。Wnt信號通路在內(nèi)耳的發(fā)育過程中主要涉及到聽板的定向分化、耳蝸管的延伸、感覺細(xì)胞的定向分化和細(xì)胞極性的調(diào)。在內(nèi)耳中,不但調(diào)控著內(nèi)耳的發(fā)育,也可以促進(jìn)耳蝸的前體細(xì)胞發(fā)生增殖。且Notch信號通路和Wnt信號通路之間存在著相互交聯(lián)(crosstalk)作用。pRb在禽類胚胎期耳囊感覺上皮的發(fā)育中有著重要的作用,但是在損失后的感覺上皮中前體細(xì)胞的增殖和再生中的作用尚不清楚；并且Notch和Wnt信號通路及其相互交聯(lián)(crosstalk)在內(nèi)耳前體細(xì)胞增殖中的作用尚未知；為研究這些內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)的信號通路在內(nèi)耳前體細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制,我們研究了pRb在損失后的新生雞橢圓囊感覺上皮中的前體細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期中的作用,以及Notch和Wnt信號通路在哺乳類動物的內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制；為進(jìn)一步通過調(diào)控相關(guān)信號通路,促使哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞再生提供新的途徑和方法。第一部分pRb在新生雞橢圓囊前體細(xì)胞增殖中的作用[目的] 研究pRb在損失后的新生雞感覺上皮中的前體細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期,發(fā)生增殖中的作用,以及MEK/ERK和Raf-1-Rb兩條信號通路在pRb蛋白的磷酸化中的作用和機(jī)制。以期在損傷后的哺乳動物感覺上皮中,通過調(diào)控pRb使內(nèi)耳前體細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期而達(dá)到毛細(xì)胞的再生奠定基礎(chǔ)。[方法]本研究通過體外培養(yǎng)新生雞(P0-P3)橢圓囊,用慶大霉素?fù)p傷橢圓囊感覺上皮后,給予5’-溴脫氧尿核苷(BrdU)及MEK/ERK信號通路的阻斷劑U0126：該阻斷劑可以特異性的阻斷MEK/ERK信號通路中的ERK磷酸化；和Rb/Raf-1通路的阻斷劑RRD-251：為Rb-Raf-1的分裂子,在體內(nèi)或體外呈pRb依賴性的有效的抑制血管生成和腫瘤的生長；分析研究其對橢圓囊感覺上皮前體細(xì)胞增殖的影響；分別采用realtime PCR的方法檢測細(xì)胞增殖過程中相關(guān)的重要的增殖基因、及信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況,及western-blot方法分析其蛋白水平的表達(dá)變化、及其磷酸化程度的改變情況。[結(jié)果] 新生雞橢圓囊感覺上皮毛細(xì)胞被慶大霉素?fù)p傷后,毛細(xì)胞大量死亡丟失,感覺前體細(xì)胞發(fā)生大量的自發(fā)再生；當(dāng)給予MEK/ERK信號通路的阻斷劑U0126及Rb/Raf-1通路的阻斷劑RRD-251后,感覺前體細(xì)胞的增殖明顯減少,呈劑量依賴性；并且通路相關(guān)基因和細(xì)胞周期的相關(guān)因子基因表達(dá)量下降,及MEK/ERK和Rb/Raf-1信號通路的相關(guān)蛋白表達(dá)下降。[結(jié)論]新生雞的內(nèi)耳感覺細(xì)胞在被損傷后,前體細(xì)胞可以大量自發(fā)的再生,因此,禽類的內(nèi)耳感覺細(xì)胞是我們研究內(nèi)耳毛細(xì)胞再生的很好的模型。pRb蛋白的磷酸化在新生雞橢圓囊的感覺前體細(xì)胞的增殖中起著重要的作用,MEK/ERK信號通路和Rb/Raf-1信號通路均參與著損失后的新生雞橢圓囊感覺上皮的pRb磷酸化過程。對于pRb在損傷后的新生雞橢圓囊前體細(xì)胞增殖中的作用的研究,為在損傷后的哺乳動物感覺上皮中,通過調(diào)控pRb使內(nèi)耳前體細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期而達(dá)到毛細(xì)胞的再生提供了新的途徑和方法。第二部分Notch和Wnt信號通路在新生小鼠內(nèi)耳前體細(xì)胞增殖中的作用[目的]研究Notch和Wnt信號通路以及兩者的相互交連作用(crosstalk),在新生小鼠內(nèi)耳前體細(xì)胞增殖及再生中的作用;為進(jìn)一步通過調(diào)控Notch或/和Wnt信號通路,促使哺乳動物內(nèi)耳毛細(xì)胞再生奠定新的理論基礎(chǔ)和方法。[方法]取新生小鼠(P0-P3)的內(nèi)耳基底膜行體外培養(yǎng),給予EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,5-乙炔基-2'-脫氧尿苷)和Notch信號通路的γ-secretase酶抑制劑DAPT或DBZ來抑制Notch信號通路；Wnt信號通路激動劑QS11以激活Wnt/β-catenin信號通路;研究Notch和Wnt信號通路以及兩條信號通路的相互交聯(lián)在正常的以及新霉素?fù)p傷后的新生小鼠基底膜上前體細(xì)胞增殖和再生中的作用；并用real-time PCR和western-blot方法對信號通路和前體細(xì)胞周期相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的變化情況進(jìn)行檢測和分析。[結(jié)果]在新生鼠正常和損傷后的感覺上皮上,給予小劑量DAPT抑制Notch通路后,促使感覺細(xì)胞區(qū)毛細(xì)胞明顯增多,且感覺細(xì)胞區(qū)可見大量的細(xì)胞發(fā)生增殖,可見增殖性再生；單獨(dú)給予Wnt信號通路激動劑QS11,毛細(xì)胞和支持細(xì)胞無明顯改變,亦未見明顯細(xì)胞增殖。當(dāng)同時給予DAPT和QS11后,促使感覺細(xì)胞區(qū)毛細(xì)胞明顯增多,可見大量的細(xì)胞發(fā)生增殖,發(fā)生增殖的細(xì)胞數(shù)量較單獨(dú)使用Notch信號通路抑制劑DAPT促進(jìn)增殖的細(xì)胞數(shù)量更為明顯；對相關(guān)信號通路及內(nèi)耳感覺細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平的改變情況進(jìn)行分析顯示：小劑量γ-secretase酶抑制劑抑制Notch信號通路后,可以使其下游基因Hes1下調(diào),當(dāng)同時用Wnt信號通路激動劑后,上調(diào)了Hes1的表達(dá)；單獨(dú)抑制Notch通路和同時抑制Notch并激活Wnt通路,均使Math1、c-myc-2的表達(dá)上調(diào)。并且在單獨(dú)使用DAPT或DAPT和QS11同時使用后,β-catenin蛋白的表達(dá)量均升高。[結(jié)論]小劑量的γ-secretase酶抑制劑抑制Notch信號通路后可以促進(jìn)內(nèi)耳感覺前體細(xì)胞發(fā)生增殖性再生；且Wnt信號通路可以進(jìn)一步協(xié)同促進(jìn)抑制Notch信號通路引起的感覺前體細(xì)胞的增殖性再生；推測是由于Hes1等基因的表達(dá)上調(diào),而增強(qiáng)了Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)耳前體細(xì)胞的增殖性再生。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764

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本文編號：2524466