【摘要】： 鼻咽癌(Nasoparyngeal carcinoma, NPC)是我國南方一些省(自治區(qū))的常見惡性腫瘤之一。目前放射治療是鼻咽癌治療的基本方法,但中晚期鼻咽癌治療后常常復發(fā)或向遠處轉移,對于復發(fā)和轉移的患者在臨床上尚無有效治療方案。樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)為基礎的疫苗在治療腫瘤方面,尤其在某些晚期腫瘤如黑色素瘤、前列腺癌、結腸癌、尿道癌的臨床治療方面已經取得一些的成效,現在已進入Ⅱ期臨床試驗。但DC在治療NPC方面,還處于起始階段。 目前治療用的DC是其前體細胞在細胞因子作用下體外誘導培養(yǎng)獲得的,但對于DC誘導培養(yǎng)條件文獻報道不一。本研究首先通過對DC培養(yǎng)條件、前體細胞來源、細胞因子組合、細胞貼壁孵育時間、rAd-LMP2感染DC劑量,細胞凍融方面的進行探索,優(yōu)化了DC培養(yǎng)條件。 我們課題組以rAd-LMP2以灌胃、肌肉注射和滴鼻的方式感染小鼠,均可誘發(fā)小鼠針對LMP2的特異性體液免疫和細胞免疫；EBV-LMP2 DNA疫苗、腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)疫苗、非復制5型腺病毒疫苗(Ad5)聯合免疫Balb/C小鼠能夠更好地誘導機體產生特異性CTL。rAd-LMP2、rAd5F35-LMP2肌肉免疫恒河猴誘導EBV-LMP2特異性的CTL。pcDNAⅢ-LMP2真核表達質粒免疫小鼠可誘發(fā)LMP2特異性細胞和體液免疫。在此基礎上,我們以DC-LMP2肌肉免疫方式,研究LMP2誘導的特異性CTL。 通過與廣西自治區(qū)人民醫(yī)院合作,在獲得倫理委員會批準下,依據自愿原則,選擇部分NPC治療進行初步DC-LMP2皮內免疫治療,首次以LMP2肽庫形式檢測DC-LMP2免疫后所激發(fā)LMP2特異性CTL,探討患者特異性CTL與NPC發(fā)展進程的關系。 結果顯示：普通培養(yǎng)瓶誘導培養(yǎng)DC的效果最差,帶濾膜蓋的細胞培養(yǎng)瓶次之,六孔細胞培養(yǎng)板誘導培養(yǎng)效果最好。rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α組合對骨髓前體細胞誘導培養(yǎng)DC的效果最好,終濃度為rmGM-CSF(200U)+rmIL-4(10U)+rmTNF-α(100U)/mL;對脾臟來源DC進行誘導培養(yǎng),rmGM-CSF+rmTNF-α組合的陽性率最高,但最終獲得DC數量遠遠少于骨髓來源DC。隨著前體細胞孵育時間的增加獲得DC細胞數量也隨之增多,DC純度無明顯差異。rAd-LMP2感染骨髓細胞誘導培養(yǎng)的DC,以10、100、1000 MOI感染DC,100 MOI感染DC效果最好,40-60%的DC中有LMP2表達。苔盼藍法檢測-80℃、-196℃凍存骨髓和脾臟淋巴細胞復蘇后存活率,骨髓細胞存活率(94.8±0.7%和82.85±3.8%)均大于脾臟細胞(80.98±2.2%和68.3±5.2%),DC前體細胞凍存復蘇影響其誘導培養(yǎng)。以優(yōu)化獲得的DC培養(yǎng)條件誘導培養(yǎng)骨髓來源的DC,然后DC-LMP2免疫BALB/C鼠可誘導LMP2特異性免疫應答。第5周(308±167/106細胞,對照18±6/106細胞)強于第8周(196±81/106細胞,對照7±2/106細胞)；肌肉注射方式免疫小鼠rAd-LMP2、DC-LMP2所誘導的LMP2特異性CTL, rAd-LMP2組(1178±228/106細胞)大大高于DC-LMP2組((308±167/106細胞)。在小鼠0,2,4周免疫后的第五周,DC-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細胞亞群的比值(22.6±1.7%)高于PBS(20.4±3.5%)和DC組(22.04±1.2%),在第八周DC-LMP2免疫組CD8+T/CD3+T細胞亞群的比值(15.5±1.7%)低于PBS(17.6±2.9%)和DC組(17.5±1.5%)。在小鼠0,2,4周DC-LMP2免疫后,小鼠血清中產生LMP2抗體。 在NPC患者前臂內側下緣皮內免疫0.1 mL生理鹽水,含1-2×105個DC-LMP2,未出現明顯過敏反應,表明皮內免疫DC-LMP2的途徑、部位、劑量安全可行。參加皮內免疫的部分NPC患者,在在第五周LMP2特異性CTL檢測中,15人中9人提高了LMP2特異性CTL(/106),6人在DC-LMP2免疫后LMP2特異性CTL降低。1人在第八周的特異性細胞免疫水平高于治療前,1人低于治療前。在NPC免疫前后的IgA/VCA和IgA/EA抗體滴度無明顯改變,NPC患者經過初次臨床常規(guī)治療后3-21個月內,血清中EBV DNA載量均低于103copies/mL。 總之,rmGM-CSF+rmIL-4+rmTNF-α組合對骨髓前體細胞誘導培養(yǎng)DC的效果最好,終濃度為rmGM-CSF(200U)+rmIL-4(10U)+rmTNF-α(100U)/mL; DC-LMP2免疫BALB/C鼠可誘導LMP2特異性CTL。CD8+T/CD3+T細胞亞群的比值先升高。DC-LMP2免疫NPC患者的的途徑、部位、劑量安全可行,部分NPC患者提高了LMP2特異性CTL。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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1 周玲,姚慶云,Steve.Lee,A.Rickinson,曾毅;鼻咽癌病人和正常人群中EB病毒特異性T細胞對靶抗原的識別和應答[J];病毒學報;2001年01期

2 ;Induction of cytotoxic T lymphocyte respones in vivo after immunotherapy with dendritic cells in patients with nasopharyngeal carcinoma[J];Journal of Microbiology and Immunology;2006年01期

3 楊松梅;王湛;周玲;杜海軍;莫武寧;曾毅;;攜帶EBV-LMP2基因的DNA疫苗、腺相關病毒疫苗和腺病毒疫苗免疫小鼠的特異性細胞免疫應答[J];中國科學(C輯:生命科學);2009年04期

4 姚家偉,周玲,王琦,左建民,曾毅;EB病毒潛伏膜蛋白2重組腺病毒的構建及其免疫效果的研究[J];中國腫瘤;2003年01期

5 王湛;周玲;吳小兵;盧覓佳;宣堯仙;左建民;李峰;王琦;葉樹清;曾毅;;Ad-LMP2重組腺病毒疫苗在恒河猴體內免疫效果的研究[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2006年02期

6 朱偉嚴,周玲,王琦,姚家偉,曾毅;EB病毒潛伏膜蛋白2DNA疫苗的構建及其初步免疫效果觀察[J];中華微生物學和免疫學雜志;2002年02期

7 左建民,周玲,王琦,曾毅;含EBV-LMP2基因重組腺病毒疫苗的構建及其誘導CTL應答的初步探討[J];中華微生物學和免疫學雜志;2003年06期

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本文編號：2326234