本文關(guān)鍵詞：Nods樣模式識別受體在變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜中的表達及意義

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【摘要】：背景 變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一種發(fā)病廣泛、呈全球蔓延的鼻腔過敏性疾病,據(jù)文獻報道發(fā)病率在10-20%之間,影響全球約30%成人和40%的兒童。它嚴重困擾著人們生活、學(xué)習(xí)和工作。其發(fā)病涉及環(huán)境及遺傳兩個方面,目前治療主要為藥物治療為主。ARIA:將其定義為一種難于治愈但可以長期控制的疾病。因而有必要闡明發(fā)病機制,探尋新的治療措施。其中感染因素對變態(tài)反應(yīng)的影響存在爭論。主要體現(xiàn)在“衛(wèi)生假說”提出的早期感染保護論及感染抑制變態(tài)反應(yīng)。如Aaby[2]等報道了在法國兒童中,嬰幼兒時期接種分枝桿菌能夠阻止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生,對和感染加重變態(tài)反應(yīng)這兩個方面。因此感染的影響成為該疾病的研究方向之一。 微生物刺激鼻黏膜引起機體啟動天然免疫,第一步即識別,主要通過病原體本身的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)與黏膜細胞模式識別受體(Pattern Recognition Receptor, PRR)來實現(xiàn),PRR是存在于細胞的種類繁多的受體蛋白家族,他們可以識別病原微生物(細菌、病毒等)標記或來自宿主本身的危險信號,進而觸發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明,PRR參與了包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)病。PRR中研究較多的是Toll樣受體,分布在細胞表面和特異的細胞器,如內(nèi)吞型溶酶體[3],主要識別的是胞外微生物,其在識別細胞表面的致敏原進而在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,在這一領(lǐng)域已有較多研究。但一些微生物可以逃避細胞膜PRR,進入細胞內(nèi)。如何識別此類病原體及胞內(nèi)菌,引起研究者的不斷探索。后來發(fā)現(xiàn)Nod樣模式受體(Nod like receptors, NLRs)具有這種功能。近年來,這種新近發(fā)現(xiàn)但“古老,,的模式受體在包括過敏反應(yīng)在內(nèi)的上呼吸道炎癥反應(yīng)中的作用正受到重視。NLRs研究以Nod1、Nod2及Nalp3為主,對于Nod樣受體家族在變應(yīng)性鼻炎方面的作用目前文獻報道較少。 NLRs可識別細胞質(zhì)中的微生物成分。Nodl通過meso-DAP識別微小結(jié)構(gòu)二肽,meso—DAP(二氨基庚二酸)是多數(shù)革蘭氏陰性菌和一些革蘭氏陽性菌的特征性成分。Nod2主要識別微小結(jié)構(gòu)胞壁酰二肽(muramyldipeptide, MDP),是一種存在于所有革蘭氏陽性和陰性菌胞壁內(nèi)具有生物活性的最小肽聚糖模體。Nod1、Nod2識別各自配體后,激活Rip2(絲氨酸、蘇氨酸激酶Rip2),進而激活促細胞分裂劑激活性蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF-kappaB),再進而促使前IL-1β的合成；Nalp3屬于PYD亞家族分子,它能夠識別細菌RNA、尿酸結(jié)晶物、ATP和某些細菌毒素.氫氧化鋁(白礬)等。而Nalp1b和Cryopyrin/Nalp3(又名NLRP3)識別配體后,可促進炎癥小(inflammasomes)的合成,進而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1,也稱為IL-1p轉(zhuǎn)換酶.),產(chǎn)生IL-1p的成熟分子或可促進細胞凋亡。 研究發(fā)現(xiàn)[5],國內(nèi)變應(yīng)性鼻炎主要的室內(nèi)變應(yīng)原是屋塵螨。機體是如何識別屋塵螨的變應(yīng)原和相關(guān)成分?模式識別受體TLR發(fā)揮了重要的作用。如Der p1主要通過TLR2識別,LPS通過TLR4識別,與變應(yīng)性鼻炎有關(guān)。但是TLR僅僅是分布于胞膜和胞內(nèi)內(nèi)涵體的受體,對于其他的病原體,如可逃避胞膜進入胞質(zhì)的成分,TLR則不能識別,而NLR卻可以識別。而屋塵螨的結(jié)構(gòu)中恰恰存在這樣的成分,主要在胞內(nèi)識別。所以,研究NLR在屋塵螨引起的天然免疫的發(fā)病作用,顯得十分關(guān)鍵。 Jacquet等[6]認為,HDM中可以檢測出微生物組分,包括脂多糖LPS和b-葡聚糖類,這些成分似乎和HDM真正的抗原成分一樣重要,通過模式識別受體的激活,引起Th2的極化。但是僅有佐劑成分能否激活天然免疫,卻需要進一步研究。他著重說明強調(diào),屋塵螨骨架蛋白包含殼多糖,并可以被表面模式識別受體TLR-2識別,產(chǎn)生促炎和前炎癥介質(zhì)。而另外的文獻說明,佐劑殼聚糖(基于殼多糖的聚合糖),和二氧化硅、石棉,氫氧化鋁一樣,都能激活NLRP3(即NALP3),并且可以通過抗原提呈細胞進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。說明模式識別受體NALP3在屋塵螨變應(yīng)原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面,可起到關(guān)鍵作用。殼多糖在屋塵螨引起的天然免疫中可發(fā)揮一定作用,但其中的機制需要進一步研究。 Hysi等[9]通過nod1基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn),Card4的變異和哮喘增高的易感性有關(guān)。細胞內(nèi)模式識別受體nod1識別細菌特異性產(chǎn)物,影響了兒童哮喘的發(fā)病率。哮喘與變應(yīng)性鼻炎“一個氣道,一種疾病”,故nod1基因多態(tài)性可能與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病有關(guān)。 因此,NLR對機體免疫功能有一定影響,對變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病有一定作用,可能體現(xiàn)在：1.感知微生物,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。2.激活后可以引起Th2細胞因子的釋放,從而加重或維持變應(yīng)性鼻炎炎癥狀態(tài)。3.感知佐劑,增強免疫應(yīng)答。4.其基因多態(tài)性可能與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病有關(guān)。 本研究擬深入探討NLR受體(Nod1、Nod2、Nalp3)在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的作用,現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。 目的 探討Nods(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域,Nod Like receptors)樣模式識別受體(PRR)在變應(yīng)性鼻炎患者下鼻甲黏膜組織中的表達及作用,并研究變應(yīng)性鼻炎下鼻甲黏膜IL-4、IL-6、IL-10、IFN-r的表達情況,以鼻中隔偏曲患者下鼻甲黏膜、鼻息肉做對照。提取變應(yīng)性鼻炎外周血單個核細胞,比較變應(yīng)性鼻炎患者脫敏治療6個月前后單個核細胞Nod1表達的變化,及脫敏治療前后血清、鼻分泌物中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ變化情況,探索Nodl表達變化和細胞因子變化之間的關(guān)系。 方法 2011年9月至2012年9月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院門診變應(yīng)性鼻炎(AR)患者,根據(jù)AIRA2010(依據(jù)臨床表現(xiàn)、鼻腔檢查情況、皮膚點刺實驗結(jié)果或血清變應(yīng)原特異性IgE檢測)入組；對照組1：期間因鼻中隔偏曲行單純鼻中隔偏曲矯正術(shù)患者；對照組2：慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP, chronic rhinosinusitis with nasal polyps)住院患者(根據(jù)EPOS2007指南標準納入研究組)。本項研究得到了南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會的批準,且征得所有研究對象知情簽字同意。 分別采用real-time RT-PCR、western-blot及免疫組織化學(xué)檢測Nod1、od2、 NALP3mRNA及蛋白在變應(yīng)性鼻炎患者下鼻甲黏膜(患者下鼻甲黏膜,以下簡稱黏膜)表達,以鼻中隔偏曲患者代償側(cè)下鼻甲黏膜、鼻息肉粘膜做對照。 ELISA測變應(yīng)性鼻炎黏膜(組織勻漿液)IL-4、L-6、IL-10、 IFN-γ的表達量,以鼻中隔偏曲下鼻甲黏膜,鼻息肉組織做對照。 western-blot測變應(yīng)性鼻炎患者舌下特異性免疫脫敏治療6個月前后外周血單個核細胞Nod1的表達變化。 ELISA測變應(yīng)性鼻炎患者脫敏治療6個月前后血清、鼻腔分泌物IL-4、IL-6、 IL-10、IFN-γ表達變化。 結(jié)果 1.Real-Time RT-PCR顯示：變應(yīng)性鼻炎黏膜組織Nod1mRNA表達較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.31, P=0.00),NALP3mRNA表達較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01,P=0.01),Nod2mRNA表達與正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉比較無明顯差別,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06,P=0.10)。 2.western-blot結(jié)果提示：變應(yīng)性鼻炎黏膜組織Nod1表達低于正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉組(均為P=0.00),NALP3高于正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉(均為P=0.00), Nod2三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.52,P=0.29)。 3.免疫組織化學(xué)表明,三種模式受體在三組中均有表達,主要表達于上皮細胞、腺體上皮、炎性細胞(如漿細胞、嗜酸性粒細胞),變應(yīng)性鼻炎黏膜組織Nod1表達較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均低(P=0.01,P=0.00),NALP3表達較較正常對照下鼻甲粘膜、鼻息肉均高(P=0.01, P=0.01), Nod2蛋白表達三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.14)。 4.脫敏治療前后,變應(yīng)性鼻炎患者外周血單個核細胞均能檢測出Nodl表達,治療前(相對量1.06±0.13,)較正常對照組(0.29±0.05)相比,表達升高(P=0.00),治療后表達量(0.34±0.15)降低,前后差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。 5.鼻粘膜IL-4.IL-6與Nodl呈正相關(guān),分別為r=0.751,p=0.001, r=0.826,p=0.000,相關(guān)密切。變應(yīng)性鼻炎黏膜IL-4、IL-6、IL-10與鼻中隔偏曲組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(單位：pg/mg,15.22±1.17vs13.02±4.60,254.67±27.3vs206.00±62.56,20.25±2.75vs24.11±3.81,P=0.53,0.27,0.20),但均低于鼻息肉患者組(25.80±2.20,1133.09±312.08,51.10±17.22,P=0.00,0.00,0.01)。IFN-γ低于鼻中隔偏曲組(20.50±2.00vs28.19±7.63, P=0.04),與鼻息肉組相比(19.89±5.01,P=0.86),無統(tǒng)計學(xué)差異。 6.舌下脫敏治療6月前后變應(yīng)鼻炎血清細胞因子濃度分別：治療前IL-6(8.25±0.93) pg/ml,治療后(6.39±0.71) pg/ml,降低,P=0.00；治療前IL-10(2.66±0.48) pg/ml,治療后(4.78±0.44) pg/ml,升高,P=0.00；治療前IFN-y (2.90±0.68)pg/ml,治療后(9.82±0.85) pg/ml,升高(P=0.00)。鼻腔分泌物IL-4降低(P=0.01),IL-6、IL-10、IFN-γ兩組無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.33,P=0.19,P=0.18)。 7.舌下脫敏治療后,外周血單個核細胞Nodl表達改變與外周血IL-10的改變呈負相關(guān),r=-0.884,p=0.002,相關(guān)密切。Nodl表達改變與IL-6的改變呈正相關(guān),r=0.574,p=0.106. 結(jié)論 1. Nod1、Nod2及NALP3在三組組織中均有表達,變應(yīng)性鼻炎組Nodl表達低于正常對照組、鼻息肉組,NALP3高于正常對照組、鼻息肉組。說明Nod1、NALP3有可能參與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病。 2.變應(yīng)性鼻炎外周血單個核細胞存在Nod1表達,且舌下脫敏治療后,外周血單個核細胞Nod1表達降低,其表達降低與外周血IL-10的改變呈負相關(guān),Nodl可能通過調(diào)控IL-10變化,參與舌下脫敏治療。
【關(guān)鍵詞】：Nods 樣模式識別受體 變應(yīng)性鼻炎 變應(yīng)原舌下脫敏
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R765.21
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-23
• 第一部分 變應(yīng)性鼻炎患者鼻粘膜NLRS表達研究23-45
• 第一節(jié) 變應(yīng)性鼻炎患者鼻粘膜NLRs基因表達研究23-30
• 第二節(jié) 變應(yīng)性鼻炎患者鼻粘膜NLRs蛋白表達研究30-38
• 第三節(jié) 變應(yīng)性鼻炎患者鼻粘膜NLRs免疫組織化學(xué)研究38-45
• 第二部分 變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜TH1/TH2細胞因子檢測及與NLR關(guān)系45-51
• 1. 材料和方法45-48
• 2. 實驗結(jié)果48-51
• 第三部分 脫敏治療前后變應(yīng)性鼻炎患者外周血單個核細胞的NOD1改變及與血清、分泌物TH1/TH2細胞因子的改變關(guān)系研究51-59
• 1. 材料和方法51-52
• 2. 實驗結(jié)果52-59
• 討論59-66
• 全文結(jié)論66-67
• 參考文獻67-74
• 綜述74-85
• 英文縮寫85-86
• 倫理審查同意書86-87
• 在讀期間發(fā)表論文87-88
• 致謝88-89

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