本文關(guān)鍵詞：UCP2在硫酸吲哚酚誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用和機(jī)制研究

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【摘要】：心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥和首位死亡原因。隨著透析技術(shù)的提高,尿毒癥患者的生存時(shí)間得以延長(zhǎng),但與此同時(shí)心臟暴露于尿毒癥狀態(tài)的時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)。因此明確尿毒癥狀態(tài)下CVD的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)措施已成為當(dāng)前腎病領(lǐng)域需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。心肌肥厚是CKD患者最常見(jiàn)的心臟病理改變,也是心衰及心臟猝死發(fā)生的重要原因,但其具體發(fā)病機(jī)制目前還不清楚。既往的研究認(rèn)為高血壓、貧血、高容量負(fù)荷等因素與CKD狀態(tài)下左室肥厚(Left ventricular hypertrophy,LVH)的發(fā)病有關(guān)。但是,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),上述傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素不足以解釋CKD狀態(tài)下LVH的高發(fā)病率,有學(xué)者認(rèn)為尿毒癥毒素可能是CKD患者CVD高發(fā)病率的重要原因。因此,從分子或細(xì)胞水平探討尿毒素心血管損害的具體機(jī)制,并以此為基礎(chǔ)尋找有效干預(yù)措施將具有非常重要的意義。硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)是一種小分子尿毒癥毒素,正常人體內(nèi)含量低于0.1-2.39μM,但由于其親蛋白特性,傳統(tǒng)透析很難將其清除,隨著CKD患者病情進(jìn)展,血清IS水平甚至可高達(dá)500μM以上。研究表明,IS在腎臟纖維化、血管平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)皮功能紊亂中均發(fā)揮重要作用,而且CKD患者血清IS水平與其CVD的發(fā)病率及死亡風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。另外,有報(bào)道證實(shí)LVH主要發(fā)生于CKD的3,4期并隨CKD的惡化而加重,而IS恰好也在CKD3期開(kāi)始升高,這就提示IS可能與CKD患者LVH的發(fā)生相關(guān)。此外,新近多項(xiàng)研究及我們課題組的研究發(fā)現(xiàn)IS可以通過(guò)促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,但是,IS促進(jìn)氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的具體機(jī)制仍不明確。解偶聯(lián)蛋白(Uncoupling protein,UCP)是一類(lèi)位于線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可通過(guò)改變線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子梯度參與能量代謝過(guò)程。目前已發(fā)現(xiàn)5種UCPs同系物,其中UCP2廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物心、腎、肝等多種組織器官,可通過(guò)降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子梯度減少三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的合成。此外,UCP2還參與細(xì)胞活性氧(Reactive oxidative species,ROS)生成、胰島素分泌等多種生理過(guò)程。既往研究提示ucp2可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度等途徑減少心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)血管內(nèi)皮、防止動(dòng)脈硬化斑塊形成�；谀壳耙延械难芯窟M(jìn)展,人們發(fā)現(xiàn)ucp2主要在能量代謝異常和對(duì)抗氧自由基損傷方面發(fā)揮著重要作用,然而這類(lèi)結(jié)果主要源于糖尿病、維生素d缺乏癥等代謝性疾病的研究,ucp2在尿毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和心肌肥大中的作用及機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。所以,我們擬在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確ucp2是否在is促進(jìn)氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(ampactivatedproteinkinase,ampk)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,廣泛表達(dá)于人體各組織,在心臟尤為豐富。既往的研究表明,ampk激活后可以上調(diào)ucp2,減少能量消耗,對(duì)抗氧化應(yīng)激,發(fā)揮積極的心血管保護(hù)作用。最近多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),ampk激動(dòng)劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶(amino-imidazolecarboxamideribonucleotide,aicar)及二甲雙胍等可以通過(guò)激活ampk抑制心肌細(xì)胞肥大。因此,ampk調(diào)控ucp2的這種上下游關(guān)系是否參與了is誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大亦成為本課題研究的一個(gè)關(guān)鍵內(nèi)容。為此,本研究以體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,以is為主要處理因素,通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染、免疫熒光組織化學(xué)染色、westernblot、核素示蹤、realtimepcr等多種技術(shù),對(duì)ucp2在is誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了探討。我們的研究分為以下三個(gè)部分:(1)觀察is對(duì)大鼠心肌細(xì)胞ros生成及細(xì)胞肥大的影響;(2)觀察is對(duì)心肌細(xì)胞ucp2表達(dá)的影響,并通過(guò)制備ucp2慢病毒顆粒,轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,觀察ucp2過(guò)表達(dá)對(duì)is誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ros生成的影響;(3)通過(guò)激活/抑制ampk的活性,明確ampk調(diào)控ucp2在is誘導(dǎo)ros產(chǎn)生及促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大中的作用。最終闡明ucp2在is誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用和分子機(jī)制。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下:一、is促進(jìn)ros過(guò)量生成并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大:與對(duì)照組相比,is處理組心肌細(xì)胞ros生成明顯增多,且存在劑量依賴性;另外,我們發(fā)現(xiàn)500μmis處理48h后,心肌細(xì)胞的體積、蛋白合成速率及心房利鈉肽(atrialnatriureticfactor,anf)、腦鈉肽(brainnatriureticpeptide,bnp)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosinheavychain,β-mhc)mrna表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加,提示is可以促進(jìn)ros過(guò)量生成并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。二、is可以下調(diào)心肌細(xì)胞ucp2表達(dá):用500μmis作用心肌細(xì)胞,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),心肌細(xì)胞ucp2蛋白水平逐漸下降。之后再用不同濃度的is作用心肌細(xì)胞1h,發(fā)現(xiàn)UCP2表達(dá)水平亦呈下降趨勢(shì),提示IS可以下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)UCP2蛋白表達(dá)水平,并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。三、UCP2過(guò)表達(dá)可以抑制IS誘導(dǎo)的ROS生成:首先用重組UCP2慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,繼而觀察UCP2過(guò)表達(dá)對(duì)IS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS生成的影響。我們發(fā)現(xiàn)與IS及IS+空載體組相比,IS+UCP2過(guò)表達(dá)組ROS生成明顯減少,提示IS通過(guò)下調(diào)UCP2表達(dá)促進(jìn)ROS生成,而上調(diào)UCP2表達(dá)則可以抑制IS誘導(dǎo)的ROS生成。四、AMPK激活可以抑制IS誘導(dǎo)的UCP2下調(diào)及ROS生成:我們用500μM IS處理心肌細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平明顯下降,同時(shí)AMPK激活劑AICAR預(yù)孵育可以抑制IS誘導(dǎo)的UCP2下調(diào),提示IS下調(diào)UCP2蛋白表達(dá)與其抑制AMPK激活有關(guān)。另外,與IS組相比,ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)孵育組及AICAR預(yù)孵育組ROS生成量明顯減少。提示IS可能通過(guò)抑制AMPK激活下調(diào)UCP2表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量生成。五、AMPK激活或UCP2過(guò)表達(dá)可以拮抗IS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大:以細(xì)胞體積、蛋白合成速率及ANF、BNP、β-MHC mRNA表達(dá)水平作為心肌細(xì)胞肥大的觀察指標(biāo),觀察AMPK激活及UCP2過(guò)表達(dá)對(duì)IS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單純IS處理組相比,UCP2過(guò)表達(dá)組及AICAR預(yù)孵育組心肌細(xì)胞體積較小、蛋白合成速率較慢、ANF、BNP、β-MHC的mRNA表達(dá)水平較低。提示AMPK激活或UCP2過(guò)表達(dá)可以拮抗IS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。綜上所述,我們的課題研究表明,IS可以通過(guò)抑制AMPK激活下調(diào)心肌細(xì)胞UCP2的表達(dá),從而誘導(dǎo)ROS過(guò)量生成,導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生,而UCP2過(guò)表達(dá)或AMPK激活可以明顯拮抗IS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。提示IS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大可能與AMPK/UCP2/ROS信號(hào)通路有關(guān)。通過(guò)我們的研究,不僅進(jìn)一步證實(shí)了尿毒癥毒素在CKD患者心肌肥厚中的重要作用,也從一定程度闡明了IS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生機(jī)理,為臨床預(yù)防及治療尿毒癥心肌病提供了更充足可靠的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：解偶聯(lián)蛋白2 硫酸吲哚酚 AMPK 尿毒癥心肌病 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R54
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 IS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用及機(jī)制研究15-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 2.3 結(jié)果22-28
• 2.4 討論28-29
• 2.5 小結(jié)29-30
• 第三章 UCP2過(guò)表達(dá)可抑制IS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激30-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-35
• 3.3 結(jié)果35-39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 第四章 AMPK激活或UCP2過(guò)表達(dá)可抑制IS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大41-53
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料41-44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法44
• 4.3 結(jié)果44-51
• 4.4 討論51-52
• 4.5 小結(jié)52-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 文獻(xiàn)綜述 解耦聯(lián)蛋白2在心血管疾病中的研究進(jìn)展61-71
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文及成果71-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐新麗;楊可;管旭;肖堂利;何婷;余彥琳;劉亮;趙景宏;;UCP2在硫酸吲哚酚誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年22期

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本文編號(hào)：901174