目的：研究一種新型的AAV重組病毒（rAAV8-hFVIII）治療血友病A的治療效果,并在病毒設(shè)計(jì)構(gòu)建中引入定點(diǎn)整合概念,為血友病A的基因治療提供方向。方法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中引入兩個(gè)種群的老鼠：攜帶人體AAVS1位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠（AAV小鼠）和敲除FⅧ的基因小鼠（FVIII KO小鼠）,將其分為高壓注射組,正常注射組和溶劑空白對(duì)照組。目的基因表達(dá)方面,我們使用ELISA檢測(cè)hFVIII蛋白1、7、14、21、35、60、90天抗原抗體表達(dá)情況；在100天時(shí),殺死小鼠取其心、肝、脾、肺、腎,使用RT-PCR檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)錄情況。生理出凝血指標(biāo)方面,我們采用活化部分凝血活酶時(shí)間檢測(cè)法來觀察30天時(shí)FVIII KO小鼠內(nèi)源性凝血指標(biāo)的變化,同時(shí)用小鼠斷尾法檢測(cè)小鼠生理出血時(shí)間的變化。AAVS1特異位點(diǎn)整合方面,我們?cè)诓糠諥AV小鼠上加入Rep共同高壓注射,使用nested PCR檢測(cè)接頭序列,并在100天時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行肝臟部分切除手術(shù),使用Real-time PCR觀察其表達(dá)變化。結(jié)果：FⅧ抗原檢測(cè)結(jié)果顯示,在使用相同給藥方式的條件下,兩種不同模型動(dòng)物的蛋白表達(dá)相似,一般在病毒注射60... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
目錄
英文縮略詞
第一章 前言
第二章 材料與方法
    一、實(shí)驗(yàn)材料
        1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料
        2、其它制劑、溶液
        3、常用試劑配制
        4、主要儀器設(shè)施
        5、計(jì)算機(jī)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)
    二、實(shí)驗(yàn)方法
        1、瓊脂糖凝膠電泳方法
        2、pMD18-T載體和目的基因的連接
        3、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        4、質(zhì)粒的小量制備
        5、組織DNA抽提
        6、組織mRNA抽提
        7、高壓尾靜脈快沖注射
        8、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與血漿、血清采集
        9、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血漿中hFⅧ抗原
        10、FⅧKO小鼠出血時(shí)間測(cè)定與APTT部分凝血酶激活時(shí)間檢測(cè)
        11、RT-PCR檢測(cè)hFⅧ mRNA
        12、肝臟部分切除
        13、Real-time PCR檢測(cè)病毒在體內(nèi)的表達(dá)
        14、鼠肝PCR擴(kuò)增檢測(cè)病毒-AAVS1整合位點(diǎn)接頭序列
        15、ELISA檢測(cè)小鼠血清中hFⅧ抗體的相對(duì)水平
        16、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    一、hFⅧ表達(dá)及其抗體形成
        1、hFⅧ在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況
        2、抗hFⅧ抗體水平
    二、模型動(dòng)物的出、凝血指標(biāo)
        1、小鼠出血時(shí)間
        2、APTT部分活化的凝血活酶時(shí)間
    三、病毒的體內(nèi)分布、表達(dá)及特異性位點(diǎn)整合情況
        1、RT-PCR檢測(cè)病毒進(jìn)入肝臟后在器官內(nèi)分布情況
        2、nested PCR檢測(cè)AAVS1接頭位點(diǎn)序列
        3、Real-time PCR檢測(cè)肝切前后肝臟rAAV8-hFⅧ表達(dá)
第四章 討論與結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
致謝



本文編號(hào)：3639712