目的：研究鈉通道β1亞基新的突變A197V在Brugada綜合征發(fā)病中的意義。在體外細(xì)胞系HEK293水平共轉(zhuǎn)鈉通道α亞基SCN5A與突變?chǔ)?亞基,通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)明確SCN1B/A197V對(duì)鈉通道電生理學(xué)特性的影響。建立基于患者特異性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）,為心肌分化、電生理研究及基因治療提供基礎(chǔ)。方法：1.臨床明確診斷的10例Brugada綜合征患者進(jìn)行6種編碼基因的測(cè)序,以發(fā)現(xiàn)與該病相關(guān)的新的基因位點(diǎn)突變。2.構(gòu)建基于突變的表達(dá)質(zhì)粒,并通過酶切及直接測(cè)序證明質(zhì)粒構(gòu)建的成功。3.將含突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定及膜片鉗技術(shù)檢測(cè),以明確該基因突變位點(diǎn)對(duì)離子通道特性的影響。4.原代培養(yǎng)患者皮膚成纖維細(xì)胞,使用Yamanaka的SKOM（SOX2、KLF4. OCT4、C-MYC）四質(zhì)粒系統(tǒng)感染皮膚成纖維細(xì)胞,在特定的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)生成基于患者特異性的iPSCs。結(jié)果:1.基因測(cè)序結(jié)果表明其中一位具有Ⅰ型Brugada綜合征心電圖的46歲患者發(fā)現(xiàn)編碼鈉通道β1亞基的SCN1B第4外顯子發(fā)... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

酶切驗(yàn)證位點(diǎn)Figure5SiteofPstIdigestion

結(jié)果如圖B。于是我們選擇突變型M1，M3與野生型WT1，WT3進(jìn)行全質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序引物為CMV forward固定引物。測(cè)序結(jié)果顯示突變型Ml野生型WT1,WT3含有正確插入片段，與酶切結(jié)果一致。

2重組SCN1B-PIRES2-EGFP質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證重組野生型及誘變型SCNlB-pIRES2-EGFP經(jīng)過測(cè)序證實(shí)含有所要求的SCN1B編碼區(qū)，其中堿基誘變結(jié)果見下圖，可見原有堿基C被T代替。


本文編號(hào)：3101741