第一部分地西他濱誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征細胞發(fā)生鐵死亡及其機制目的骨髓增生異常綜合征(MDS)是常見的骨髓衰竭綜合征,多伴鐵過載;鐵死亡是調(diào)節(jié)性細胞死亡的形式之一,具有獨立的形態(tài)、生化及遺傳特性,可能參與MDS的發(fā)生和發(fā)展,有望成為治療的新靶點。地西他濱是治療MDS的經(jīng)典去甲基化藥物之一。本項研究擬探討其是否能誘導(dǎo)MDS細胞發(fā)生鐵死亡及其作用機制。方法1.細胞系SKM-1、MUTZ-1分別與地西他濱及鐵死亡抑制劑Fer-1共培養(yǎng),CCK-8法檢測藥物在不同時間、不同濃度下對細胞活力的影響,同時觀察Fer-1、necrostatin-1(程序性壞死特異性抑制劑)、z-vad-fmk(凋亡特異性抑制劑)及DFO(鐵螯合劑)能否逆轉(zhuǎn)地西他濱對細胞的抑制作用。CCK-8法檢測鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin聯(lián)合地西他濱對MUTZ-1細胞活性的影響;2.流式細胞術(shù)檢測Fer-1、DFO、erastin單藥或聯(lián)合地西他濱作用于SKM-1、MUTZ-1細胞后ROS水平的變化;3.生化法檢測地西他濱及Fer-1、DFO處理MUTZ-1細胞后谷胱甘肽(GSH)含量變化;生化法檢測地西他濱、Fer-1、GSH、necrostatin-1、z-vad-fmk處理MUTZ-1細胞后谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)活性的變化。結(jié)果1.Necrostatin-1、z-vad-fmk可顯著增加MUTZ-1的細胞活力,necrostatin-1可顯著增加SKM-1的細胞活力(P0.05),Fer-1、necrostatin-1、DFO均可部分逆轉(zhuǎn)地西他濱對SKM-1、MUTZ-1細胞的生長抑制作用,其中鐵死亡抑制劑Fer-1的逆轉(zhuǎn)作用最為顯著(P0.05);erastin聯(lián)合地西他濱組細胞活力低于erastin單藥組和地西他濱單藥組,盡管協(xié)同作用不顯著(Q1.15);2.地西他濱作用于SKM-1、MUTZ-1后細胞內(nèi)ROS水平增高,且可被鐵死亡特異性抑制劑Fer-1及鐵螯合劑DFO抑制。Erastin、地西他濱共培養(yǎng)組可使細胞內(nèi)ROS水平進一步增加;3.地西他濱可使MUTZ-1細胞內(nèi)GSH含量明顯降低,可被Fer-1逆轉(zhuǎn)。地西他濱可使MUTZ-1細胞內(nèi)GPXs活性下降,該作用可被Fer-1、necrostatin-1、z-vad-fmk或外源性GSH逆轉(zhuǎn)。結(jié)論1.MDS的發(fā)病機制可能主要涉及程序性壞死與凋亡,地西他濱誘導(dǎo)MDS細胞死亡的主要方式可能是程序性壞死與鐵死亡;2.地西他濱可引起鐵死亡相關(guān)性ROS水平增加;3.地西他濱可能通過降低細胞內(nèi)GSH含量及GPXs活性誘導(dǎo)MDS細胞發(fā)生鐵死亡。第二部分鐵過載誘導(dǎo)小鼠骨髓單個核細胞發(fā)生鐵死亡目的MDS患者常伴有鐵過載,本研究擬通過構(gòu)建C57BL/6小鼠鐵過載模型,觀察鐵過載是否能誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生,為鐵過載患者的治療提供新思路。方法1.C57BL/6小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵,構(gòu)建小鼠鐵過載模型;2.通過ELISA法檢測小鼠外周血鐵蛋白水平,肝、脾病理切片顯示鐵沉積以驗證鐵過載模型是否成功構(gòu)建;共聚焦顯微鏡顯示小鼠骨髓單個核細胞內(nèi)二價鐵離子的數(shù)量,流式細胞術(shù)定量檢測熒光強度;3.檢測外周血血紅蛋白數(shù)量,觀察鐵過載程度與貧血程度之間是否存在線性關(guān)系;4.Fer-1(鐵死亡抑制劑)、necrostatin-1(程序性壞死抑制劑)、z-vad-fmk(凋亡抑制劑)、erastin(鐵死亡誘導(dǎo)劑)、DFO(鐵螯合劑)分別作用于小鼠骨髓單個核細胞,CCK-8法檢測各組細胞活力,流式細胞術(shù)檢測ROS水平的變化,生化法檢測谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)活性的變化。結(jié)果1.通過給小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵成功建立了小鼠鐵過載模型;2.鐵過載導(dǎo)致肝臟、脾臟、骨髓鐵沉積,外周血血紅蛋白(Hb)下降;鐵過載小鼠骨髓單個核細胞內(nèi)二價鐵離子數(shù)量顯著高于對照組;小鼠外周血血紅蛋白濃度與細胞內(nèi)Fe2+水平、鐵蛋白濃度均呈負相關(guān);3.鐵過載可導(dǎo)致細胞活力降低,細胞活力與細胞內(nèi)Fe2+水平呈負相關(guān);4.Fer-1、necrostatin-1可部分逆轉(zhuǎn)鐵過載組細胞活力的下降,erastin可促進鐵過載小鼠骨髓單個核細胞增殖(P0.05);5.鐵過載小鼠骨髓單個核細胞內(nèi)ROS水平顯著增加(P0.05),細胞內(nèi)GSH含量及GPXs活性下降。鐵螯合劑可提高細胞內(nèi)GSH水平,鐵死亡抑制劑、凋亡抑制劑及鐵螯合劑可顯著增加高劑量鐵劑組小鼠BMMNCs的GPXs活性(P0.05)。結(jié)論1.鐵過載可導(dǎo)致小鼠貧血,且貧血程度與鐵過載程度呈正相關(guān);2.程序性壞死與鐵死亡可能在鐵過載小鼠的細胞活力減低中發(fā)揮一定的作用;3.隨著鐵過載程度的加重,細胞內(nèi)Fe2+的水平及ROS水平增加;4.Erastin可促進鐵過載小鼠骨髓單個核細胞增殖;5.鐵過載可能導(dǎo)致程序性壞死及鐵死亡相關(guān)性ROS升高;6.鐵螯合劑可提高鐵過載小鼠BMMNCs內(nèi)GSH水平;7.鐵過載導(dǎo)致的GPXs活性下降可能與鐵死亡及凋亡相關(guān);第三部分地西他濱誘導(dǎo)MDS患者骨髓單個核細胞發(fā)生鐵死亡目的分別探討鐵死亡在低危及高危MDS患者發(fā)病機制中的作用,為MDS的治療提供理論依據(jù)。方法1.分別提取低危MDS、高危MDS及淋巴瘤患者的骨髓單個核細胞,與地西他濱共培養(yǎng),同時觀察Fer-1、necrostatin-1(程序性壞死特異性抑制劑)、z-vad-fmk(凋亡特異性抑制劑)及DFO(鐵螯合劑)能否逆轉(zhuǎn)地西他濱對三組細胞的抑制作用。CCK-8法檢測鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin聯(lián)合地西他濱對三組細胞活性的影響;2.流式細胞術(shù)檢測三組患者骨髓單個核細胞(BMMNCs)內(nèi)ROS水平;生化法檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的含量與谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs)活性。結(jié)果1.Fer-1、necrostatin-1、z-vad-fmk均可顯著逆轉(zhuǎn)地西他濱對低危BMMNCs的抑制作用(P0.05),necrostatin-1和Fer-1可較為明顯地逆轉(zhuǎn)地西他濱對高危BMMNCs的抑制作用,盡管差異不顯著(P0.05);2.地西他濱可導(dǎo)致MDS患者細胞內(nèi)ROS水平顯著增加(P0.05),Fer-1可顯著抑制該作用(P0.05),erastin可增加該作用(低危組P0.05,高危組P0.05);3.對于低危MDS患者,Fer-1、necrostatin-1、z-vad-fmk能顯著逆轉(zhuǎn)地西他濱對GSH水平的抑制作用(P0.05),對于高危MDS患者,Fer-1、necrostatin-1能顯著逆轉(zhuǎn)地西他濱對GSH水平的抑制作用(P0.05)。Erastin聯(lián)合地西他濱可導(dǎo)致GSH水平進一步降低,在高危MDS組差異顯著;4.對于低危MDS組,Fer-1、z-vad-fmk聯(lián)合地西他濱組的GPXs活性較地西他濱組顯著升高(P0.05),erastin可使GPXs活性進一步下降(P0.05)。對于高危MDS組,Fer-1、necrostatin-1聯(lián)合地西他濱組的GPXs活性較地西他濱組顯著升高(P0.05),erastin可使GPXs活性進一步下降(P0.05)。結(jié)論1.地西他濱在低、高危MDS患者中的作用機制可能有差異,在低危MDS患者中以誘導(dǎo)鐵死亡及凋亡為主,在高危MDS患者中以誘導(dǎo)程序性壞死及鐵死亡為主;2.地西他濱通過誘導(dǎo)MDS患者BMMNCs細胞內(nèi)ROS水平的增加導(dǎo)致細胞發(fā)生鐵死亡;3.對于低危MDS患者,地西他濱通過誘導(dǎo)BMMNCs發(fā)生程序性壞死、鐵死亡、凋亡導(dǎo)致GSH水平降低。對于高危MDS患者,地西他濱通過誘導(dǎo)程序性壞死、鐵死亡導(dǎo)致GSH水平降低;4.地西他濱主要通過鐵死亡、凋亡抑制低危MDS細胞內(nèi)GPXs活性,通過鐵死亡、程序性壞死抑制高危MDS細胞內(nèi)GPXs活性。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R551.3
【部分圖文】：

圖 1：GPX4 利用谷胱甘肽清除脂質(zhì)過氧化物[6]常綜合征（MDS）是最為常見的成人獲得性骨髓衰特征，是髓系腫瘤的異質(zhì)性集合。其主要特征包括少、易轉(zhuǎn)化為急性髓系白血�。ˋML）等，總體生病率為 3-4/105[8]�；疾÷孰S年齡的增長而增加，例病率為 7-35/105，男性高于女性[8]。示，50%-80%的 MDS 患者存在鐵過載，祛鐵治療。MDS 患者發(fā)生鐵過載的機制主要包括：（1）輸血

14圖 2 地西他濱誘導(dǎo)鐵死亡現(xiàn)象與其作用濃度及時間的關(guān)系（*P＜0.05）1.2.2 不同細胞死亡方式抑制劑及地西他濱對 MDS 細胞活力的影響為觀察 Fer-1（鐵死亡特異性抑制劑）、necrostatin-1（程序性壞死抑制劑） 、z-vad-fmk （凋亡抑制劑）、DFO（鐵離子螯合劑）對地西他濱抑制細胞活力的影響，設(shè)立對照組、地西他濱組、地西他濱+Fer-1 組、地西他濱+necrostatin-1 組、地西他濱+z-vad-fmk 組、地西他濱+DFO 組及單用各細胞死亡抑制劑組，分別作用于 MUTZ-1、SKM-1 細胞 48 小時，CCK-8 法檢測各組細胞活力(圖 3A)。結(jié)果顯示，necrostatin-1、z-vad-fmk 單藥可顯著增加 MUTZ-1 的細胞活力，

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文necrostatin-1 單藥可顯著增加 SKM-1 的細胞活力（P<0.05）；necrostatin-1、Fer-1和 DFO 均可部分逆轉(zhuǎn)地西他濱對 MUTZ-1、SKM-1 細胞的生長抑制，F(xiàn)er-1 的作用最為顯著（P<0.05），而 z-vad-fmk 則無此作用。說明 MDS 的發(fā)病機制可能主要涉及程序性壞死與凋亡，地西他濱誘導(dǎo) MDS 細胞死亡的主要方式可能是程序性壞死與鐵死亡。

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本文編號：2821932