發(fā)布時間：2020-09-16 09:48

　　 研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種由于機(jī)體的胰島素分泌缺陷或其生物作用功能受損或兩種異常狀態(tài)同時存在所導(dǎo)致的、以長期高糖血癥和代謝紊亂為特征的代謝性疾病。糖尿病可累及多器官并發(fā)展為糖尿病相關(guān)并發(fā)癥。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心血管系統(tǒng)最常見的并發(fā)癥。由于糖尿病心肌病患者體內(nèi)的糖、脂能量代謝紊亂、微血管病變,引發(fā)心肌廣泛灶性壞死、組織纖維化,可出現(xiàn)心律失常、心功能下降,甚至發(fā)生心力衰竭,因此糖尿病心肌病也是糖尿病患者中死亡率、致殘率較高的并發(fā)癥。防治糖尿病心肌病是目前亟待解決的公共健康問題。氧化應(yīng)激在DCM的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。活性氧、活性氮自由基可直接損傷心肌細(xì)胞蛋白和DNA,激活炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)DCM病程發(fā)展。有動物實驗研究表明,應(yīng)用能夠抗氧化應(yīng)激的藥物如蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)、白藜蘆醇(resveratrol)、姜黃素(curcumin)等干預(yù)DCM,可以部分逆轉(zhuǎn)糖尿病所致的心功能損害。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路是機(jī)體抵抗內(nèi)、外應(yīng)激刺激的重要防御性信號傳導(dǎo)通路。在組織、細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時,Nrf2激活并上調(diào)多種抗炎癥、抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),被認(rèn)為是機(jī)體防御系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的核心因子之一。已有研究發(fā)現(xiàn),激活并上調(diào)Nrf2及下游抗氧化基因的表達(dá)可在糖尿病所致心肌損傷過程中發(fā)揮心肌保護(hù)作用;并在體外實驗中發(fā)現(xiàn),Nrf2基因沉默后,抗氧化應(yīng)激藥物對糖尿病誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷失去保護(hù)作用。盡管動物實驗證實Nrf2在糖尿病誘發(fā)的心肌氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、纖維化改變及細(xì)胞凋亡等過程中有保護(hù)作用,但進(jìn)入臨床應(yīng)用的、通過激活Nrf2通路達(dá)到心肌保護(hù)作用的藥物仍然很少。富馬酸二甲酯(DMF)又稱BG-12,是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的治療成人多發(fā)性硬化癥的口服藥。在人體和動物體內(nèi)的實驗均證實,DMF能夠激活Nrf2通路,誘導(dǎo)胞漿內(nèi)Keap1-Nrf2復(fù)合物的解偶聯(lián),使Nrf2入核并上調(diào)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,抵抗自由基、炎性因子、有毒代謝物等對細(xì)胞的損傷,具有良好的抗氧化應(yīng)激作用。由于氧化應(yīng)激及其對心肌的損傷在DCM發(fā)生發(fā)展過程中占有重要地位,因此認(rèn)為,DMF針對DCM的抗氧化應(yīng)激作用可能是DCM防治的潛在新策略。研究目的:本研究擬通過藥物誘導(dǎo)建立DCM(1型糖尿病)小鼠模型,經(jīng)DMF連續(xù)治療,探討DMF對DCM心肌損傷的治療作用,分析DMF心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制,試圖為DMF可能應(yīng)用于DCM的臨床預(yù)防和治療提供實驗數(shù)據(jù)和理論參考。研究方法:針對8周齡雄性C57BL/6J小鼠經(jīng)過連續(xù)低劑量腹腔注射STZ(50mg/kg)建立1型糖尿病小鼠模型,進(jìn)而發(fā)展為DCM小鼠模型,通過檢測血糖水平,評價1型糖尿病小鼠模型的成功與否;設(shè)置相同周齡的雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射鏈脲霉素溶劑—檸檬酸鈉鹽(p H4.5,0.1mol/L)溶液,作為鏈脲霉素溶劑對照組。將疾病模型組和溶劑對照組各分成2組,共4組,分別進(jìn)行不同的給藥處置:(1)Ctrl組:溶劑對照小鼠腹腔注射生理鹽水;(2)Ctrl+DMF組:溶劑對照小鼠腹腔注射DMF溶液;(3)T1D組:1型糖尿病小鼠腹腔注射溶劑;(4)T1D+DMF組:1型糖尿病小鼠腹腔注射DMF溶液。DMF溶于生理鹽水給藥量為10mg/kg,每日給藥,連續(xù)12周。在給藥的12周內(nèi),每月定期記錄小鼠體重、血糖;通過無創(chuàng)心臟超聲評價小鼠心臟功能和結(jié)構(gòu);12周治療結(jié)束后,麻醉并處死實驗小鼠,解剖取其心肌組織,提取蛋白、m RNA或進(jìn)行組織切片,觀察檢測心肌纖維化改變(如天狼星紅染色、CTGF、TGF-β1);觀察心肌組織的形態(tài)改變;利用ELISA和Western blot方法在蛋白水平并利用實時定量PCR在基因轉(zhuǎn)錄水平檢測心肌組織促炎癥因子(TNF-α、PAI-1、IL-1β)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、氧化應(yīng)激水平(SOD活性、AGES產(chǎn)物、NADPH氧化酶活性、3-NT、4HNE)等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上各相關(guān)因子的水平改變;進(jìn)一步檢測抗氧化應(yīng)激通路上,Nrf2轉(zhuǎn)錄因子及其下游抗氧化蛋白酶(如SOD、NQO-1、HO-1、catalase)等具有清除多余氧化產(chǎn)物的蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。通過數(shù)據(jù)比較和分析,得出結(jié)論。研究結(jié)果:(1)富馬酸二甲酯治療不影響糖尿病小鼠或?qū)φ战M小鼠的血糖水平和體重。首先,在12周治療的時間里,T1D小鼠和Ctrl小鼠相比,T1D小鼠空腹血糖始終明顯高于Ctrl小鼠。在經(jīng)DMF或溶劑治療后,T1D小鼠和Ctrl小鼠血糖均未明顯改變。其次,在比較小鼠心臟重量時,采用心臟重量與脛骨長度之比(HW/TL)。比較發(fā)現(xiàn),T1D小鼠HW/TL較Ctrl小鼠稍低,但沒有顯著性差異。而DMF治療或溶劑治療并未導(dǎo)致HW/TL改變。(2)富馬酸二甲酯治療通過增加射血分?jǐn)?shù)、抑制心肌重構(gòu)挽救了DCM心功能的下降。應(yīng)用超聲心動圖測量顯示,同Ctrl小鼠相比,T1D小鼠心臟左室EF和FS值都顯著降低,舒張末期和收縮末期左心室內(nèi)徑(LVID)、左室容積(LV vol.)顯著增大。DMF治療后,T1D小鼠心臟左室EF值、收縮末期左心室容積(LV vol;s),比溶劑治療的T1D小鼠明顯減小。這些改變具有顯著性差異。另外,DMF部分降低了T1D小鼠舒張末期和收縮末期左心室內(nèi)徑(LVID)和舒張末期左室容積(LV vol;d),升高了T1D小鼠左室FS,但并沒有顯著性差異。(3)富馬酸二甲酯治療后,通過降低TGF-β1等纖維化相關(guān)因子,抑制了DCM的心肌纖維化改變。天狼星紅染色顯示T1D小鼠心肌纖維化改變較Ctrl小鼠顯著。而DMF治療明顯降低T1D小鼠心肌纖維化程度。通過rt-PCR評估纖維化相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)T1D小鼠心肌中TGF-β1、CTGF、和纖連蛋白(fibronectin)、膠原蛋白(collagen I)的m RNA轉(zhuǎn)錄較Ctrl小鼠明顯增加,而DMF治療使得T1D小鼠上述m RNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。此外,應(yīng)用Western blot測得DMF治療的T1D小鼠TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)水平較溶劑治療的T1D小鼠的有所降低,但無顯著性差異。(4)富馬酸二甲酯通過降低促炎因子和粘附分子,降低了DCM心肌組織促炎癥反應(yīng)和炎癥浸潤。應(yīng)用rt-PCR檢測實驗小鼠心肌組織內(nèi)促炎因子TNF-α、白細(xì)胞介素(IL-1β)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)發(fā)現(xiàn),與Ctrl小鼠相比,T1D小鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的m RNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。而DMF治療的T1D小鼠中,TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的m RNA轉(zhuǎn)錄被明顯抑制。另外,通過Western blot檢測TNF-α、PAI-1、ICAM-1蛋白水平,DMF治療的T1D小鼠,上述炎性因子較溶劑治療的T1D小鼠明顯降低。(5)富馬酸二甲酯通過減少自由基來源和提高抗氧化應(yīng)激的酶和蛋白的表達(dá)明顯抑制了DCM心肌中氧化應(yīng)激的水平。通過ELISA以及Western blot實驗方法發(fā)現(xiàn),與Ctrl小鼠相比,T1D小鼠SOD活性顯著下降,GSH水平明顯降低,同時氧化產(chǎn)物(3-NT、4HNE)水平明顯升高,AGEs產(chǎn)物CML加和物增多。同時,超氧陰離子的重要來源--巨噬細(xì)胞相關(guān)NADPH氧化酶活性在T1D心臟中也顯著升高。DMF治療,降低了T1D小鼠心肌3-NT、4HNE水平、減少了AGEs生成,抑制了NADPH氧化酶活性;同時促進(jìn)SOD活性,升高GSH含量,提高了心肌抗氧化應(yīng)激能力。(6)富馬酸二甲酯對DCM的保護(hù)作用與激活T1D小鼠心肌細(xì)胞Nrf2及其下游的抗氧化基因的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。通過Western blot、rt-PCR的實驗方法發(fā)現(xiàn),與Ctrl小鼠相比,在T1D小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白總量明顯增加;而與T1D小鼠相比,T1D+DMF小鼠Nrf2蛋白總量升高更顯著。因Nrf2入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用,于是提取心肌細(xì)胞核蛋白并檢測Nrf2含量,結(jié)果顯示,相對于其他各組,只有經(jīng)DMF治療的T1D小鼠心肌細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2明顯升高。進(jìn)一步檢測Nrf2下游抗氧化應(yīng)激酶、蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),發(fā)現(xiàn)在T1D+DMF治療組,小鼠心肌細(xì)胞ho-1、sod1、catalase基因的m RNA轉(zhuǎn)錄水平較T1D組都明顯升高。相似的,T1D+DMF小鼠HO-1、SOD2和catalase酶蛋白表達(dá)也明顯升高。而T1D小鼠抗氧化應(yīng)激的各種酶都有不同程度的降低。DMF治療并未影響Ctrl小鼠Nrf2及其下游基因的表達(dá)水平。結(jié)論:(1)富馬酸二甲酯可以改善糖尿病所致的心臟結(jié)構(gòu)損傷和功能異常。(2)富馬酸二甲酯對糖尿病心肌病心肌組織的保護(hù)作用與Nrf2激活并上調(diào)其下游抗氧化通路酶和蛋白的表達(dá)水平具有高度的相關(guān)性。(3)富馬酸二甲酯在DCM預(yù)防或治療中具有重要的應(yīng)用潛力。創(chuàng)新性:(1)本研究首次發(fā)現(xiàn)了DMF對糖尿病心肌病的保護(hù)作用。(2)首次闡明DMF對DCM的保護(hù)作用主要是通過Nrf2的表達(dá)上調(diào)及其下游抗氧化基因的表達(dá)上調(diào),抗擊心肌組織氧化應(yīng)激而實現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R542.2
【部分圖文】：

臟收縮功能和舒張功能改變的影響，糖尿病和心肌肥大具有獨立相關(guān)性[49, 50]。與心肌肥大的非糖尿病患者相比，糖尿病患者肥大的心肌組織左室舒張功能下降更嚴(yán)重[49]。許多動物實驗研究明確了 DCM 心肌肥大的證據(jù)，如心臟重量和體重的比值（HW/BW）（前提是每組個體體重平均值在各組之間沒有差異性）、心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL）、心肌細(xì)胞體積、致肥大基因表達(dá)等[51]。此外，T2DM 所致心肌肥大在超聲影像中表現(xiàn)為心室壁回聲密度增強(qiáng)。提示心肌肥大可能是由膠質(zhì)蛋白沉積的改變而非心肌肥大性改變所致[52, 53]。因此，對于 DCM 心肌肥大性改變的病理、分子機(jī)制仍需更透徹的認(rèn)識和進(jìn)一步研究。

在糖尿病患者中，經(jīng)過統(tǒng)一調(diào)整患者年齡，糖尿病患病時間、腎功能、壓以及自主功能參數(shù)后，血漿中的 AGEs 水平與左室等容舒張期時長以及心僵硬程度成正比。另外 Kranstuber 和 Bidasee 等[76, 77]實驗表明，心肌細(xì)胞AGEs 可以交聯(lián) SERCA2a 導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣離子回收通道受損，導(dǎo)致心肌收縮功障礙，而長期應(yīng)用 AGEs 交聯(lián)拮抗劑（AGEs crosslink breaker）治療，可以使分肌漿網(wǎng)鈣回收功能接近正常。又有研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷 AGEs 受體 RAGE左室心肌收縮力得到改善[59, 78, 79]。這提示 RAGE 參與心肌收縮相關(guān)機(jī)制，同強(qiáng)調(diào) AGEs-RAGE軸調(diào)節(jié)對于 DCM 病理生理調(diào)節(jié)的重要性。因此，以 AGEs其相關(guān)通路為靶向的治療策略或許能夠改善 DCM 心功能。

低 IL-1β、TNF-α 炎性因子水平），緩解心肌纖維化和心衰等表現(xiàn)。同時發(fā)現(xiàn)，在小鼠糖尿病模型中通過抑制 p38 mitogen-activated protein kinase蛋白激酶，降低了心肌組織中的促炎癥因子，從而改善了心室功能障礙。近期研究發(fā)現(xiàn)，激活的重要促炎癥轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 在多種細(xì)胞中（包括 T1DM、T2DM 小鼠模型，人心肌細(xì)胞、高湯處理的冠脈內(nèi)皮細(xì)胞等）加重了 ROS/RNS的生成。這兩項研究均表明，在糖尿病小鼠模型的心肌組織中，抗炎作用藥物同時能夠降低氧化應(yīng)激、減少心肌細(xì)胞的死亡、抑制心肌重構(gòu)和改善的糖尿病個體心臟的收縮功能障礙，如圖 2.3 所示。盡管目前許多證據(jù)證明，炎癥反應(yīng)是 DCM 潛在的重要靶點，然而能否通過藥物調(diào)控炎性細(xì)胞因子或相關(guān)通路達(dá)到臨床治療的目的，尚需深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馮新星;陳燕燕;;糖尿病心肌病的研究進(jìn)展[J];中國循環(huán)雜志;2015年01期

本文編號：2819712