目的:本課題通過構(gòu)建波動性高糖對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(human coronary artery endothelial cells,HCAECs)損傷的模型,研究黃連素(Berberine,BBR)對波動性高糖誘導的人冠狀動脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用,并探究其可能的分子機制。方法:培養(yǎng)HCAECs,將HCAECs分為5組:A組為正常血糖組(5.5mmol/L葡萄糖,NG);B組為持續(xù)性高糖組(25mmol/L葡萄糖,PHG);C組為波動性高糖組(5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖每24小時波動一次,IHG);D組為波動性高糖+黃連素干預組(5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖+50μmol/L黃連素每24小時波動一次,IHG+BBR);E組為波動性高滲環(huán)境(不加入葡萄糖,加入與IHG相同濃度的甘露醇,保持與IHG相同的波動性高滲環(huán)境,OC)。各組細胞每24小時換含2%血清濃度的維持液1次,共培養(yǎng)7天后進行后期實驗。用噻唑藍(MTT)法測定各處理組HCAECs的細胞活力;TUNEL染色及流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平;利用相應檢測試劑盒分別測定活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等氧化應激標志物水平;酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)檢測白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和人單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等炎癥指標的蛋白水平;Western blotting方法檢測Caspase-3、NADPH氧化酶4(Nox4)、核因子κB p65(NF-κB p65)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)等蛋白的表達;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1、Caspase-3、Nox4、NF-κB p65、AGEs、RAGE mRNA表達水平。結(jié)果:1、細胞活力:與正常血糖組NG組相比,持續(xù)性高糖組PHG組細胞活力降低(P0.05);與PHG組相比,波動性高糖組IHG組細胞活力降低更明顯(P0.05)。用黃連素干預后,IHG+BBR組較IHG組細胞活力顯著增強(P0.05)。2、細胞凋亡:在細胞水平用TUNEL法及流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,在分子水平利用qRT-PCR及Western blotting技術(shù)分別檢測凋亡效應分子Caspase-3轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平。與NG組相比,PHG組細胞凋亡明顯增加(P0.05),且IHG組細胞凋亡更加顯著(P0.05)。在波動性高糖中加入黃連素,IHG-BBR組較IHG組細胞凋亡明顯減少(P0.05)。但波動性高滲環(huán)境OC組細胞凋亡不明顯(P0.05)。3、炎癥反應:與NG組和OC組相比,PHG及IHG組IL-13、TNF-α、MCP-1水平顯著升高,相反IL-10表達水平則顯著降低(P0.05)。而與PHG組相比,IHG組變化幅度更大(P0.05)。然而,在IHG組中加入黃連素后,IHG+BBR組較IHG組IL-1β、TF-α、MCP-1表達水平明顯下調(diào),IL-10表達水平升高(P0.05),表明黃連素干預后炎癥反應得到了明顯改善。4、氧化應激:與NG組及OC組相比,PHG組及IHG組ROS、Nox4、MDA含量增加,SOD活力下降(P0.05)。但PHG組與IHG組兩組間進行比較,IHG組ROS、Nox4、MDA水平較PHG組升高更明顯,SOD活力降低更明顯(P0.05)。與IHG組比較,IHG+BBR組ROS、Nox4、MDA生成減少,SOD活力出現(xiàn)明顯上升趨勢(P0.05)。5、NF-κB p65表達:IHG組較PHG組NF-κB p65的蛋白及mRNA表達量均顯著增加(P0.05)。然而,與IHG組相比,IHG+BBR組HCAECs的NF-κB p65蛋白和mRNA水平明顯下調(diào)(P0.05)。6、AGEs及RAGE生成:與PHG組相比,IHG組細胞內(nèi)AGEs和RAGE的蛋白和mRNA表達量升高(P0.05)。在IHG組中加入黃連素干預,IHG+BBR組較IHG組AGEs和RAGE的蛋白和mRNA表達量明顯下降(P0.05)。結(jié)論:1、波動性高糖較持續(xù)性高糖更易引起人冠狀動脈內(nèi)皮細胞的炎癥反應、氧化應激,降低細胞活力,促使晚期糖基化終末產(chǎn)物及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體生成,激活NF-κB信號通路,促進細胞凋亡。波動性高糖對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞的損傷作用更明顯,且損傷作用與滲透壓無關(guān)。2、黃連素對波動性高糖誘導的人冠狀動脈內(nèi)皮細胞具有明顯的保護作用,該作用機制可能與黃連素抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體生成,減弱NF-κB信號通路下游分子NF-κB p65表達,減輕人冠狀動脈內(nèi)皮細胞的炎癥反應及氧化應激相關(guān)。
【學位單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R54
【部分圖文】：

凍存的ＨＣＡＥＣｓ經(jīng)復蘇，在１０％邋ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培養(yǎng)基中培養(yǎng)２４ｈ后，通過倒置熒光逡逑顯微鏡觀察，ＨＣＡＥＣｓ細胞形態(tài)多為橢圓形或多角形，細胞排列緊密，鋪滿孔底，胞質(zhì)逡逑豐富，界限清晰，呈“鋪路石”樣鑲嵌排列。見圖３－１。逡逑Ａ逡逑圖３－１倒置熒光顯微鏡下觀察ＨＣＡＥＣｓ的生長形態(tài)（４０Ｘ）逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＣＡＥＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋（４０Ｘ邋）逡逑３１逡逑

２．不同葡萄糖培養(yǎng)條件及黃連素干預對ＨＣＡＥＣｓ細胞活力的影響逡逑首先，我們利用ＭＴＴ法檢測不同處理條件下ＨＣＡＥＣｓ的細胞活力，我們發(fā)現(xiàn)按照不同逡逑條件處理ＨＣＡＥＣｓ后，各組間ＨＣＡＥＣｓ的細胞活力出現(xiàn)了明顯差異，結(jié)果如圖３－２所示。在逡逑持續(xù)性高糖環(huán)境下細胞活力有所降低，與正常血糖組ＮＧ比較，ＰＨＧ組細胞活力降低（Ｐ＜逡逑０．０５）；但與ＰＨＧ組相比，ＩＨＧ組細胞活力降低程度更明顯（Ｐ＜０．０５），說明波動性高糖逡逑較持續(xù)性高糖對細胞產(chǎn)生更不利的影響。但是ＩＨＧ＋ＢＢＲ組比ＩＨＧ組細胞活力增強（Ｐ＜０．０５），逡逑提示黃連素干預后，波動性高糖組細胞活力增強，黃連素有效減弱了波動性高糖對ＨＣＡＥＣｓ逡逑細胞活力造成的不利影響。逡逑１２０邋ｒ逡逑Ｈｕｍ逡逑ＭＧ邐ＰＨＧ邐ＩＨ６邐ＯＣ邐ＩＨＧ＋ＢＢＲ逡逑圖３－２河�。保Хz測各組細胞活力（＃與？１＾３對比？＜０．０５；￥與１１＾對比？＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ邋ＭＴＴ邋ｍｅ

３．１邋ＴＵＮＥＬ法檢測各組ＨＣＡＥＣｓ的凋亡情況逡逑對各組ＨＣＡＥＣｓ進行相應處理后，利用ＴＵＮＥＬ方法檢測各組細胞的凋亡情況，結(jié)果逡逑如圖３－３所示。與正常血糖組ＮＧ對比，ＰＨＧ組細胞發(fā)生凋亡情況明顯增強，且變化顯著逡逑（Ｐ＜０．０５）；而相對于ＰＨＧ組，ＩＨＧ組細胞凋亡情況更加顯著（Ｐ＜０．０５），凋亡細胞明逡逑顯增多，說明波動性高糖較持續(xù)性高糖對細胞的損傷更大；而在波動性高糖環(huán)境下添加黃逡逑連素，相較于ＩＨＧ組，其ＩＨＧ＋ＢＢＲ組細胞凋亡情況明顯好轉(zhuǎn)（Ｐ＜０．０５），說明黃連素對逡逑由波動性高糖誘發(fā)的細胞凋亡具有明顯的保護作用，但波動性高滲環(huán)境０Ｃ組細胞凋亡情逡逑況較ＮＧ組變化不明顯（Ｐ＞０．０５）。逡逑ＮＧ邐ＰＨＧ邐ＩＨＧ邐ＰＣ邐ＩＨＣｒｆＢＢＲ逡逑６０逡逑＾邐Ｍ．逡逑＾邐５０邋－邐＾逡逑c涘蜽逡逑４Ｅ３邐４０邐－逡逑思邐W逡逑Ｓ邐■邐？逡逑ｉＬｍｌｍｌ逡逑ＮＧ邐ＰＨＧ邐ＩＨＧ邐ＯＣ邐ＩＨＧ＋ＢＢＲ逡逑圖３－３�。保蕖辏保磧L測各組

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