冠狀動(dòng)脈微栓塞(Coronary Microembolization,CME)被認(rèn)為是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)的主要并發(fā)癥之一。CME會(huì)導(dǎo)致冠脈慢血流或無(wú)復(fù)流,CME還會(huì)導(dǎo)致心臟收縮功能障礙和心律失常。因此,CME的發(fā)生與心肌梗死面積的進(jìn)展和患者病情預(yù)后的惡化程度密切相關(guān)。近年來(lái),微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)與CME期間心肌的凋亡和自噬密切相關(guān);然而,其中的潛在機(jī)制尚未完全闡明。miRNA是18-24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,可以通過(guò)與靶mRNA的3’-UTR成對(duì)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。由于一個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)基因,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA可以參與調(diào)節(jié)多種生化和生理活動(dòng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA具有診斷和治療心血管疾病的潛力。缺氧可嚴(yán)重改變心肌細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。以往的研究也報(bào)道過(guò)自噬與大多數(shù)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。然而,在早期心肌缺氧時(shí),心肌細(xì)胞的自噬激活相關(guān)研究目前尚未報(bào)道。在之前的一項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn),在心梗后,大鼠心肌細(xì)胞中有幾種miRNA明顯下調(diào),其中一個(gè)miRNA是miR-30e-5p。這是一種可能參與心肌細(xì)胞凋亡和自噬的miRNA。miR-30家族最近被報(bào)道參與自噬調(diào)控。然而,miR-30e-5p在CME后心肌細(xì)胞凋亡和自噬過(guò)程中的作用尚不清楚。心肌細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞,由于心臟樣本獲得的困難和人心肌細(xì)胞難以培養(yǎng),一直以來(lái)阻礙著心肌細(xì)胞相關(guān)研究的進(jìn)展。目前,大多數(shù)研究報(bào)告都是利用動(dòng)物模型來(lái)模擬心血管疾病。然而,動(dòng)物和人類心臟組織之間存在著重要的生物學(xué)和病理學(xué)差異,尤其是在心肌細(xì)胞中。近年來(lái),人源多潛能干細(xì)胞來(lái)源心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)已成為研究心血管疾病的一個(gè)理想模型。hiPSC-CMs的產(chǎn)生為體外直接評(píng)估心肌細(xì)胞功能提供了一個(gè)創(chuàng)新的方法。因此,我們利用一種新的hiPSC-CMs模型來(lái)模擬CME期間缺氧誘導(dǎo)損傷的發(fā)展。進(jìn)一步研究miR-30e-5p對(duì)hiPSC-CM凋亡和自噬影響的機(jī)制。第一部分hiPSC-CMs的獲得目的:將人源多潛能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化為hiPSC-CMs,并鑒定其心肌特性和純度。方法:體外培養(yǎng)將hiPSCs分化為心肌細(xì)胞,觀察hiPSCs的形態(tài);采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定hiPSC-CMs的特性;利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其純度。結(jié)果:傳代hiPSCs后細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),當(dāng)匯合度達(dá)90%左右時(shí),用試劑盒分化hiPSCs,分化至第10天左右可見(jiàn)成片的自主跳動(dòng)的hiPSC-CMs,將成片的hiPSC-CMs消化為單個(gè)細(xì)胞后再接種,繼續(xù)培養(yǎng)至40天。心肌鈣蛋白T(cTnT)特異性標(biāo)記心肌,利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hiPSC-CMs的特異性,可見(jiàn)40天的hiPSC-CMs具有結(jié)構(gòu)分明且成熟的肌絲和Z帶結(jié)構(gòu)。細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分化hiPSC-CMs的純度高達(dá)85%。第二部分miR-30e-5p在缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs的凋亡中的表達(dá)水平下調(diào)目的:通過(guò)建立hiPSC-CMs缺氧模型,探索hiPSC-CMs缺氧模型中miR-30e-5p表達(dá)水平的變化及凋亡水平。方法:按缺氧時(shí)間的長(zhǎng)短分組為0h、6h、12h、16h、20h、24h組,每組獨(dú)立重復(fù)3次。將hiPSC-CMs置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)構(gòu)建缺氧模型。應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)hiPSC-CMs中miR-30e-5p的表達(dá)水平,應(yīng)用Caspase-3活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hiPSC-CMs的凋亡水平。結(jié)果:1.與缺氧0h組相比,缺氧12h、16h、20h、24h組hiPSC-CMs的miR-30e-5p表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05)。2.與缺氧0h組相比,缺氧24h組hiPSC-CMs的Caspase-3活性顯著上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:miR-30e-5p在缺氧誘導(dǎo)的hiPSC-CMs凋亡過(guò)程中的表達(dá)水平下調(diào)。第三部分miR-30e-5p靶向BIM抑制缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs凋亡目的:研究miR-30e-5p與缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs凋亡的關(guān)系,探討miR-30e-5p靶向BIM調(diào)控缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs凋亡的作用。方法:將40天hiPSC-CMs分為正常組(N)、缺氧組(H)、過(guò)表達(dá)對(duì)照組(NC+H)、miR-30e-5p過(guò)表達(dá)組(miR+H)。N組置于正常培養(yǎng)箱下培養(yǎng);H組置于缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;NC+H組與miR+H組分別為穩(wěn)定感染裝載有miR-NC和miR-30e-5p的重組慢病毒后缺氧處理24h。應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)hiPSC-CMs中miR-30e-5p和BIM的mRNA表達(dá)水平,應(yīng)用Caspase-3活性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)hiPSC-CMs的凋亡水平。應(yīng)用鈣熒光技術(shù)檢測(cè)hiPSC-CMs的鈣瞬變水平,應(yīng)用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及靶蛋白BIM的表達(dá)水平。利用生物信息學(xué)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-30e-5p的靶基因,并應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:1.與N組比較,H組miR-30e-5p表達(dá)水平明顯下調(diào);與NC+H組比較,miR+H組miR-30e-5p表達(dá)水平則明顯上調(diào)。2.與N組比較,H組Caspase-3活性水平明顯升高;與NC+H組比較,miR+H組Caspase-3活性水平下降。3.與N組比較,H組hiPSC-CMs凋亡比例明顯上升;與NC+H組比較,miR+H組hiPSC-CMs凋亡比例則明顯下降。4.與N組比較,H組hiPSC-CMs鈣瞬變的振幅下降和衰減時(shí)間延長(zhǎng);與NC+H組比較,miR+H組hiPSC-CMs鈣瞬變的振幅提高和衰減時(shí)間縮短。5.與N組比較,H組凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平上調(diào);與NC+H組比較,miR+H組凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平下調(diào)。6.與N組比較,H組蛋白BIM表達(dá)水平上調(diào);與NC+H組比較,miR+H組蛋白BIM表達(dá)水平下調(diào)。7.通過(guò)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)BIM是miR-30e-5p的潛在靶基因之一;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-30e-5p能與BIM的3′UTR序列直接結(jié)合從而導(dǎo)致熒光素酶活性降低;相反,對(duì)應(yīng)的BIM 3′UTR突變結(jié)合位點(diǎn)對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有影響。結(jié)論:1.miR-30e-5p調(diào)控缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs的凋亡。2.BIM是miR-30e-5p的靶基因之一。3.miR-30e-5p靶向BIM調(diào)控缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs的凋亡。第四部分BIM介導(dǎo)自噬抑制缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs的凋亡目的:探討B(tài)IM調(diào)控缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs的凋亡的作用機(jī)制。方法:檢測(cè)NC+H組和miR+H組的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達(dá)水平,將40天hiPSC-CMs分為對(duì)照shRNA+H組(shNC+H)與shRNA BIM+H組(shBIM+H),shNC+H組與shBIM+H組分別為穩(wěn)定感染裝載有對(duì)照shRNA和BIM shRNA的重組慢病毒后缺氧處理24h。應(yīng)用Caspase-3活性實(shí)驗(yàn)和流式技術(shù)檢測(cè)hiPSC-CMs的凋亡水平。應(yīng)用鈣熒光技術(shù)檢測(cè)hiPSC-CMs的鈣瞬變水平,應(yīng)用Western blot檢測(cè)靶蛋白BIM、凋亡蛋白Caspase-3、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達(dá)水平。結(jié)果:與NC+H組相比,miR+H組的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達(dá)水平上升。經(jīng)過(guò)下調(diào)BIM表達(dá)水平后,與shNC+H組相比,shBIM+H組的Caspase-3活性、心肌細(xì)胞凋亡比例、凋亡蛋白Caspase-3下降,而自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達(dá)水平上升。結(jié)論:BIM通過(guò)介導(dǎo)自噬抑制缺氧誘導(dǎo)hiPSC-CMs的凋亡。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R541.4
【部分圖文】：

22圖 1 hiPSC-CMs 的分化及鑒定A: hiPSCs 在低倍鏡下明場(chǎng)的集落樣形態(tài)；B: hiPSCs 分化第 10 天時(shí)，成片狀的 hiPSC-CMs 形態(tài)；C:消化成單個(gè)細(xì)胞再接種后 hiPSC-CMs 的形態(tài)；D: hiPSC-CMs 的心肌特異性鑒定（紅色為 Z 帶、綠色為肌絲）。E: hiPSC-CMs 分化的純度。Figure1 differentiation and identification of hiPSC-CMs (A) The colony-like morphology of the bright fieldof hiPSCs The morphology of 10-day hiPSC-CMs (C) The hiPSC-CMs were digested into individual cells(D) Immunostaining of hiPSC-CMs after 40 days of differentiation and culture: α-actinin (red), cTnT(green), DAPI (blue). (E) Representative flow cytometry result showing the efficiency of hiPSC-CMdifferentiation.

30e-5p 靶向 BIM 調(diào)控缺氧誘導(dǎo)人源多潛能干細(xì)胞來(lái)源心肌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究 2019 屆碩士研究生學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 miR-30e-5p 表達(dá)水平將 40 天的 hiPSC-CMs 分別進(jìn)行 0h、6h、12h、16h、20h、24h 不的缺氧處理，與缺氧 0h 組相比，缺氧 12h、16h、20h、24h 組 hiPSC- miR-30e-5p 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05）。

C-CMs 的 Caspase-3 活性水平。t of hiPSC-CM viability using Caspase-3 activity miR-30 家族中的一員，它包含了 md 和 miR-30e 五個(gè)獨(dú)立的 miRNA。mi泛參與多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制[28-3力衰竭、心肌梗死、心肌肥厚及缺血/再明 miR-30 家族在心肌缺血損傷[33]的保p 在缺氧后 hiPSC-CMs 損傷中的具體作通過(guò)構(gòu)建 hiPSC-CMs 缺氧模型，miR-30e-5p 表達(dá)水平從缺氧 12h 開(kāi)始

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本文編號(hào)：2809109