【摘要】：目的:研究鈣通道相關基因CASQ2和RYR2在二乙酰嗎啡致心律失常中的作用及意義。方法:離體培養(yǎng)原代大鼠乳鼠心肌細胞,以不同濃度二乙酰嗎啡作用于心肌細胞,觀察心肌細胞形態(tài)和自發(fā)性搏動頻率及節(jié)律改變。采用膜片鉗技術檢測二乙酰嗎啡干預后心肌細胞動作電位及鈣離子通道改變。實驗分3組:對照組(N組)、二乙酰嗎啡組(H組)、二乙酰嗎啡+維拉帕米組(H+V組)。采用免疫熒光技術對各組細胞中的CASQ2和RYR2蛋白熒光強度進行檢測。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和蛋白印跡(Western blot)法分別檢測各組細胞中的CASQ2和RYR2基因的mRNA和蛋白表達量。結(jié)果:不同濃度的二乙酰嗎啡作用于原代大鼠乳鼠心肌細胞后,隨著二乙酰嗎啡濃度升高,心肌細胞形態(tài)變化明顯,細胞數(shù)量減少,細胞體積縮小,偽足數(shù)量減少;細胞核形態(tài)改變,結(jié)構(gòu)模糊;心肌細胞自發(fā)性搏動頻率及節(jié)律改變,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05)。二乙酰嗎啡作用于心肌細胞后,L型鈣通道電流I-V曲線上移,峰值與對照組相比明顯降低(對照組-14.4687?3.6107,實驗組組-4.9662?0.7708(24h)、-3.7570?2.0602(48h)),動作電位中APD90顯著增加,RP負值降低,APA顯著減小,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),N組CASQ2主要表達于細胞質(zhì),RYR2主要表達于細胞核;H組CASQ2在細胞質(zhì)內(nèi)表達降低而細胞核表達升高,RYR2在細胞核表達降低而細胞質(zhì)內(nèi)表達升高;H+V組CASQ2在細胞核和細胞質(zhì)位置均有表達,RYR2在細胞核表達減少,在細胞質(zhì)少量表達;與N組相比,H組和H+V組CASQ2和RYR2平均熒光強度降低,蛋白表達降低,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05)。通過qRT-PCR檢測3組中CASQ2和RYR2基因的mRNA水平表達量,結(jié)果顯示:H組和H+V組與N組相比,CASQ2和RYR2 mRNA相對表達量明顯降低,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05);H組與H+V組相比,CASQ2和RYR2的mRNA表達量無明顯差異,結(jié)果無統(tǒng)計學意義(P0.05)。采用Western blot法檢測發(fā)現(xiàn),與N組相比,H組和H+V組中CASQ2和RYR2蛋白表達量降低,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05);H+V組與H組相比,CASQ2和RYR2蛋白表達量降低,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:二乙酰嗎啡可致原代大鼠乳鼠心肌細胞形態(tài)發(fā)生改變,自發(fā)性搏動頻率及節(jié)律發(fā)生改變,電生理功能發(fā)生改變。維拉帕米對二乙酰嗎啡引起的原代心肌細胞自發(fā)性搏動頻率減少有一定的改善作用。CASQ2和RYR2基因與二乙酰嗎啡引起的原代大鼠乳鼠心肌細胞動作電位改變及鈣離子通道異常相關。
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.7
【圖文】：

新疆醫(yī)科大學碩士學位論文結(jié) 果1 原代大鼠乳鼠心肌細胞培養(yǎng)純度鑒定培養(yǎng)至第 7d 的原代心肌細胞經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢測鑒定：原代心肌細胞中可檢測到 -Actin 表達，細胞質(zhì)內(nèi) FITC 標記山羊抗小鼠 IgG 抗體與心肌細胞特異蛋白 -Actin 一抗結(jié)合，經(jīng) 488nm 激光激發(fā)出現(xiàn)網(wǎng)格狀或絲狀綠色熒光（圖 1.b），DAPI染料與細胞核結(jié)合，經(jīng)紫外光激光激發(fā)后出現(xiàn)圓形或橢圓形的藍色熒光（圖 1.a），合成結(jié)果可見原代心肌細胞完整形態(tài)結(jié)構(gòu)，原代心肌細胞呈多種形態(tài)，有三角形、梭形、多邊形等，細胞內(nèi)肌動蛋白呈絲狀分布，交織成網(wǎng)絡（圖 1.c）。每個培養(yǎng)皿內(nèi)隨機取 5 個視野，同時表達藍色熒光和綠色熒光的細胞為陽性細胞，表達藍色熒光的數(shù)量記為細胞總數(shù)，計算陽性細胞所占比例，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細胞純度＞97%，可以用于后續(xù)實驗。

改變數(shù)量增多。采用細胞形態(tài)及搏動狀態(tài)改變明顯的 10-4mol/L 二乙酰嗎啡濃度進行后續(xù)檢測，即為后續(xù)試驗 H 組，10-4mol/L 二乙酰嗎啡和維拉帕米干預組為后續(xù)試驗 H+V 組。采用 Dunnett-t 檢驗法用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析得出：與正常對照組相比，二乙酰嗎啡組自發(fā)性搏動頻率降低，P=0.000，說明二乙酰嗎啡對心肌細胞自發(fā)性搏動頻率有影響；與二乙酰嗎啡組相比，二乙酰嗎啡+維拉帕米組自發(fā)性搏動頻率升高，P=0.02（表 5），說明維拉帕米對此過程有一定的保護作用。a) b) c)

同濃度二乙酰嗎啡干預心肌細胞 24 小時細胞形態(tài)改(0, 10-5mol/L, 10-4mol/L, 10-3mol/L, 10-2mol/L)作用心數(shù)據(jù)三次獨立重復試驗(均數(shù)±標準差)，*P< 0.05。es of cardiomyocytes with morphological changes undne. Cardiomyocytes were switched to ium containing , 10-5mol/L, 10-4mol/L, 10-3mol/L, 10-2mol/L) in 24 hou Means±SEM of three independent experiments, *P< 表 5 不同分組中心肌細胞自發(fā)性搏動頻率( x s, n=1ous beating frequency of cardiomyocytes in different g頻率(次) P 值129.86 7.6989.57 20.63 0.000*組 103.93 14.28 0.02#比，*P＜0.05；與二乙酰嗎啡組相比，#P＜0.05。

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本文編號：2786597